研究背景

脑瘫(CP)是影响运动功能的主要神经发育紊乱(NDD)性质的疾病，世界上每1000名儿童中约有2 - 3人受到影响。运动障碍的发作发生在生命的最初几年，是大脑发育中断的一种表现。迄今为止，已有5项研究分析了CP病例的基因组拷贝数变异(CNVs)，发现10-31%的病例存在可预测的有害拷贝数变异。在CP病例中已经进行的全外显子组测序(WES)研究中，最大的一项研究报道了98个非选择性CP的父母-子女trios中约有14%存在推测的有害变异。这些研究表明了CP中潜在的重要遗传风险，但对照数据不足限制了可以做出的统计推断，并且没有对新的候选基因变异进行功能验证。在本项研究中，研究者试图解决这些问题。

研究者利用CP病例正常表型的兄弟姐妹和他们正常表型的父母组成的对照组，对250个CP trios进行了WES测序，其中包括91例既往报道的和159例来自美国、中国和澳大利亚的中心。病例在两岁时出现症状。250个家庭群体中，157例 (62.8%)为特发性（未知原因），84例（33.6%）与一个已知环境损害有关，其余9例（3.6%）无法分类。

发表时间：2020年10月

第一作者单位：耶鲁大学医学院

影响因子：27.603
 

摘要

除了常见的环境因素外，基因因素也可能导致脑瘫。研究者对250个父母-子代的trios模式（parent–offspring trios）进行了全外显子组测序，在脑瘫病例中观察到具有破坏性的新生突变的富集。8个基因具有多重破坏性的新生突变，其中两个基因的突变(TUBA1A 和 CTNNB1)在全基因组范围内具有显著性。研究者鉴定了两种新的单基因病因，FBXO31 和 RHOB，并表明 RHOB 突变增强了活性态Rho效应子结合，而 FBXO31 突变降低了cyclin D水平。候选脑瘫风险基因与神经发育障碍基因重叠。通过网络通路分析，确定了Rho GTPase的富集、细胞外基质、黏附灶和细胞骨架途径。在果蝇的反向遗传学筛查中，富集通路中的脑瘫风险基因被证明可以调节神经运动功能。研究者估计，14%的病例可归因于过度的破坏性新生或隐性变异。这些发现为基因介导的脑瘫早期神经元连接失调提供了证据。
 

主要结果

1. 损伤性新发突变（DNMs）在CP队列中显著富集，并且反复损伤性新发突变与已知的和新的CP都有关系。

研究者首先评估了新发突变对CP的贡献。案例和对照中观察到的新发突变的数量与泊松分布非常接近，表明新发突变是独立的概率事件。研究者发现，当集中分析对变异不耐受的基因时，CP病例中损伤性新发突变的富集更加明显，而对照中没有任何突变类型的显著富集（表1）。研究者推测，个体基因可能通过一种从头开始的机制在CP队列中反复出现。通过分析，鉴定到8个基因具有2个以上损伤性新发突变。这些基因中蛋白损伤性新发突变在基因水平的富集，强烈暗示这些基因是真正的CP相关基因。在这8个基因中，ATL1、CTNNB1、SPAST 和 TUBA1A 此前已报道过与人类CP表型相关，本项研究在 RHOB 和 FBXO31 中发现了相同但独立产生的损伤性新发突变。

2. 在RHOB和FBXO31中鉴定功能获得性新发突变。

RHOB 编码一个Rho GTPase，在两例不相关但表型一致的CP病例中具有两个相同的新发突变。比较RHOB蛋白的野生型和突变型（p.Ser73Phe）的结构模型，可以发现结合位点的形状和蛋白的表面电荷都发生了改变。生化分析表明，该变异对GTPase激活蛋白(GAPs)和GDP交换因子(GEFs)的反应均明显增强，最终导致与Rho效应子rhotekin在活性状态下的结合增强（图1）。

图1：CP相关的RHOB突变体S73F的功能验证。a. Sanger测序验证来自F064和F244家族的母亲、父亲和先证者的新遗传和变异位置。b. 正常与突变RHOB蛋白的Poisson–boltzmann静电图。c. F064（上）和F244（下）的脑部核磁共振图。d. GAP实验检测S73F rHOb 变体中GTP水解特性。e. 在GEF实验中，S73F rHOb变异体中GTP结合性增强。f. 与GTP结合的rho蛋白与rhotekin蛋白互作实验，S73F GTP的结合增加了4倍。

3. 研究者还在FBXO31中鉴定到两个不相关的案例具有相同的新发突变。

Asp334是FBXO31结合位点处的保守残基。FBXO31可以控制轴突的生长，对发育中的大脑中树突生长和神经元迁移至关重要。FBXO31 p.Asp334Asn影响cyclin D互作位点, 导致cyclin D降解功能明显增强。FBXO31的一个纯合截断突变已被报道与ID相关(MIM 615979)。本研究中的两名患者均表现出痉挛性双侧瘫痪CP，与已有报道的FBXO31中新发突变的表型不同 （图2）。

图2：对CP相关的FBXO31变种p.Asp334Asn的功能验证显示cyclin D调控发生了改变。a. Sanger测序显示突变位点。b. 野生型FBX031和p.Asp334Asn变种的Poisson–boltzmann静电图。c. Western blot结果显示FBXO31 p.Asp334Asn突变的患者源性成纤维细胞中cyclin D表达下降。

4. CP与其他NDDs的临床和遗传重叠。

临床上，NDDs经常同时发生。在CP病例中，约45%的CP患者并发ID，约40%的患者伴有癫痫，约7%的患者除CP外还伴有ASD。因此，研究者试图确定来自于已知NDD风险基因的CP患者中具有新发、X连锁隐性或常染色体隐性分离的罕见损伤变异体的基因。利用疾病基因网络工具DisGeNET，确定从文献和数据库(包括ClinVar、ClinGen和UniProt65)中检索到的基因和疾病之间的关联，发现在CP候选基因和主要NDDs之间有大量的基因重叠。相反，当检查与神经退行性疾病（阿尔茨海默病）的重叠时，没有发现富集。共有28.9%的CP风险基因与ID相关基因重叠，11.1%与癫痫相关，6.3%与ASD相关。分析数据表明，CP与其他遗传性NDDs有显著的遗传重叠，表明存在潜在的遗传基因的多效性和共同发生NDDs的常见病因（图3）。

图3：常见NDDs的基因重叠。a. 维恩图显示候选CP基因和与其他NDDs相关的基因之间重叠基因的数量. b. 超几何双尾试验发现，CP与其他NDDs重叠显著，而CP与阿尔茨海默病重叠不显著。

5. 细胞外基质、细胞基质局部粘连、细胞骨架网络和Rho GTPase基因与CP高度相关。

研究者鉴定了大量具有预测损伤变异的个体基因，并使用一套工具来无偏倚地发现与CP相关的保守途径和生物学功能。对439个推测的CP风险基因聚类分析显示，这些基因间的关联性大于随机预测的关联，表明存在一个包含损伤变异的功能性网络。研究者使用DAVID、MSigDB和PANTHER对其中的基因进行过表达分析，进行功能注释和通路表征，识别了代表富集通路和保守功能的多个基因集。

6. 来自Rho GTPase、细胞骨架和细胞投射通路的基因控制果蝇的神经运动发育。

研究者通过对果蝇进行反向遗传筛选，独立评估了over-represented通路成员在正常运动发育中的作用。研究者选择了具有可获得的分子特征等位基因的保守果蝇标准基因。利用双等位基因状态下的hypomorphic/LoF等位基因来辅助绘制果蝇检测中感兴趣基因的表型。两个不符合有害筛选标准的变异基因被纳入阴性对照。利用幼虫的转向测定法和成虫的负趋地性/正趋光性测定法总共筛选到22个与运动能力有关的基因（图4）。

图4：候选CP风险基因的果蝇同源体LoF突变的运动表型。a. 在AGAP1、SEMA4A 和 TENM1基因突变的幼虫中，旋转时间(一种协调运动的测量)增加了。b-j.14天大的果蝇有运动障碍。
 

参考文献

SC Jin , SA Lewis , S Bakhtiari, et al. Mutations disrupting neuritogenesis genes confer risk for cerebral palsy. Nat Genet 2020 Oct;52(10):1046-1056.

编者按

欧易生物拥有专业的动植物基因组研发团队，为客户提供基因组重测序、BSA分析、GWAS分析、群体进化分析、Agilent全外显子捕获测序、三代测序、de novo 组装、基因注释、比较基因组、个性化分析及多组学联合分析等高质量的技术服务，多名专业人员，经过多年经验沉淀积累，具备多角度分析问题能力，提供多元化项目技术服务，多组学技术平台联合支撑，极力打造一站式服务。

END