近日，山东农业大学郝玉金、由春香教授为共同通讯作者，在 The Plant Journal (IF: 6.141) 期刊发表了题为“Jasmonate induces anthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis in apple by mediating the JAZ1-TRB1-MYB9 complex”的研究论文，报道了茉莉酸通过介导 JAZ1-TRB1-MYB9 复合物诱导苹果中花青素和原花青素的生物合成。
山东农业大学安建平博士为第一作者，文章中酵母文库实验由欧易生物协助完成。
这也是继 Plant Physiology (可点击查看原文) 之后，该课题组应用欧易生物酵母文库技术发表的又一篇高水平研究论文。
研究背景
植物激素茉莉酸 (JA) 参与植物许多发育过程的调控。JAZ 蛋白是茉莉酸信号反应的阻遏物，通过抑制 JA 转录调节剂来负向调节 JA 信号。
花青素和原花青素是种子、叶、花和果实中重要的植物次生代谢产物，可充当抗氧化剂，帮助清除活性氧和对抗衰老，对人类健康具有重要价值。已有研究表明，花青素和原花青素的生物合成基因的转录受 MYB、basic helix-loop-helix (bHLH) 及 WD40 蛋白的调控。
其中，苹果 MYB 转录因子 MdMYB9 参与调控 JA 介导的花青素和原花青素的生物合成，但其分子机制仍有待深入研究。
研究内容
本研究鉴定了一个可以与 MdMYB9 相互作用的蛋白 MdTRB1。实验表明，MdTRB1 可以正向调节花青素和原花青素的累积。MdTRB1 与 MdMYB9 结合可以增强后者对下游基因的转录激活活性。而 MdTRB1 与 MdJAZ1 的结合，可以干扰其与 MdMYB9 的互作，进而负向调控 MdTRB1 介导的对花青素和原花青素积累的促进作用。本研究表明，JAZ1-TRB1-MYB9 复合物可以动态调控 JA 介导的花青素和原花青素的积累。本研究为进一步研究 JA 对花青素和原花青素生物合成的调节提供了新见解。
研究结果
1. MdTRB1 与 MdMYB9 互作
分离 MdMYB9-GFP 蛋白并结合质谱鉴定，结果显示苹果中 MdTRB1 可以与 MdMYB9 发生结合，并通过 GST-pull down 和 BiFC 实验得以证实（图 c-d）。酵母双杂交实验表明（图 a-b），MdTRB1 通过其 C 末端与 MdMYB9 发生结合。
RT-PCR 显示，外源施加茉莉酸 (JA) 处理后，MdTRB1 和 MdMYB9 表达量上升。
图 1 | MdTRB1 与 MdMYB9 互作
2. MdTRB1 以 MdMYB9 部分依赖的方式正向调节 JA 诱导的花青素和原花青素的累积
将过表达 MdTRB1 的质粒转入拟南芥，结果显示转基因种子颜色更红、DMACA 染色更深，表明 MdTRB1 促进花青素和原花青素的累积。同样过表达 MdTRB1 的苹果叶片和愈伤组织也都表现出花青素和原花青素的累积。
对过表达 MdTRB1 的苹果愈伤组织外源施加 JA 处理，可以进一步提高色素的累积；反之，在过表达 MdTRB1 的苹果愈伤组织中干扰 MdMYB9 的表达，则色素的累积受到抑制——表明 MdTRB1 对色素累积的促进作用依赖于 MdMYB9。
图 2 | MdTRB1 正向调节 JA 诱导的花青素和原花青素的累积
3. MdMYB9 与其靶基因的结合受 MdTRB1 调控
已有研究表明，MdMYB9 通过直接激活 MdANS、MdANR 的转录来促进花青素和原花青素的生物合成。EMSA 实验表明，在 MdTRB1 存在下，MdMYB9 与 MdANS、MdANR 启动子的结合能力大大增强（图 a-b）。烟草叶片内的双荧光素酶报告实验也证实了这一结论（图 c-e）。
图 3 | MdMYB9 与 MdANS、MdANR 启动子的结合受 MdTRB1 影响
4. MdJAZ1 与 MdTRB1 互作以抑制后者对花青素和原花青素累积的促进作用
如上所述，MdTRB1 参与 JA 介导的色素累积。酵母双杂交、pull down 和 BiFC 实验均显示，MdTRB1 可以通过其 C 末端与 JAZ1 蛋白互作。在苹果叶片和愈伤组织中过表达 MdJAZ1，花青素和原花青素的累积受到明显抑制。
在苹果叶片和愈伤组织中共表达 MdJAZ1/MdJAZ1，结果显示过表达 MdJAZ1 抑制了 MdTRB1 对花青素和原花青素累积的促进作用。
图 4 | MdTRB1 和 MdJAZ 互作
5. MdJAZ1 干扰了 MdTRB1 与 MdMYB9 的结合
Pull down 实验和荧光素酶互补成像实验结果表明，在 MdJAZ1 存在下，MdTRB1 与 MdMYB9 的结合减弱（图 a-c）；外源施加 JA 可以部分恢复 MdTRB1 与 MdMYB9 的结合。
图 5 | MdJAZ1 干扰了 MdTRB1 与 MdMYB9 的结合
研究结论
对于 MdTRB1 在 JA 介导的花青素和原花青素积累中的作用机制，本研究建立了一个新的模型：MdTRB1 通过与 MdMYB9 互作，增强了 MdMYB9 对下游基因的转录激活活性，进而正向调节了 JA 介导的花青素和原花青素累积。在 JA 缺乏的条件下，MdJAZ1 与 MdTRB1 互作，干扰了 MdTRB1 与 MdMYB9 之间的结合；在 JA 存在的条件下，MdJAZ1 被降解，MdTRB1 被释放出来以参与后续过程。
参考文献
An J, Xu R, Liu X, et al. Jasmonate induces anthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis in apple by mediating the JAZ1-TRB1-MYB9 complex. Plant J 2021; doi: 10.1111/tpj.15245.
