欧易生物单细胞测序近期高分文章不断，在接下来的几篇单细胞文献解读软文里，我们将为大家持续送上近期合作发表的单细胞文献解读。今天进入第一篇，5月5日由山东第一医科大学附属青岛眼科医院周庆军和史伟云教授团队在Ocular Surface (IF 12.336) 期刊发表的关于眼角膜缘组织分子图谱的相关成果，值得一提的是，欧易生物陆瑶和董娇阳也被列入了本篇文章的署名作者。
基本信息
材料：4个健康人的6例角膜缘组织；小鼠整个角膜组织（4只混样）；
期刊：Ocular Surface
发表时间：2021年5月5日
方法：欧易生物10x Genomics scRNA-seq
研究背景和研究目的
角膜是眼球壁外层前部的透明部分，具有保护眼球内结构和屈光的作用。其中，具有屏障保护性作用的角膜上皮细胞发挥关键作用，它对于清晰和稳定的视力至关重要，而位于角膜缘的干细胞又是维持和修复在角膜上皮细胞的关键细胞群。目前，关于角膜缘干细胞的分子特征及其与角膜缘微环境细胞的互作机理仍处于初步研究阶段。本研究期望通过单细胞测序全面解析眼角膜缘组织分子图谱特征，尤其关注角膜缘上皮细胞和干细胞的分子特征。
研究内容概述
对4个健康人的6例角膜缘组织进行单细胞转录组测序，结果共获得47,627个细胞用于下游分析，结果共鉴定得到8个细胞类型。包括上皮细胞、基质细胞以及其他一些稀有细胞类型。随后，作者解析了角膜缘上皮细胞和角膜缘干/祖细胞的异质性特征和阶级状态，通过拟时序分析构建了角膜缘上皮细胞发育轨迹（角膜缘干祖细胞-基底上层细胞-表层细胞），单细胞分辨率上完善了上皮细胞稳态维持的 X-Y-Z 假说。随后，作者通过细胞间通讯分析和富集分析，系统地描绘了参与上皮稳态的分子通路以及细胞间通讯作用关系网络。此外，作者还揭示了免疫细胞、血管和淋巴内皮细胞在维持角膜的免疫状态豁免和血管生成豁免的关键贡献。最后，与小鼠的跨物种比较分析表明，角膜缘干细胞和生态位细胞中存在保守性和差异性的转录信号。
具体研究内容解析
1.人角膜缘细胞的单细胞转录组图谱特征
Figure 1. 取样方案和细胞类型鉴定
Figure 1A展示了该篇文章的取样方案，经过质控后，结果共获得47,627个细胞用于下游分析。基于已有的marker基因，作者共将14个cluster归属于8个细胞类型（Figure 1B-1E），其中，作者重点关注的角膜缘上皮细胞占比最多（~53%）（Figure 1D）。此外，为了进一步阐明每个细胞类型的生物学功能特征，作者分别做每个细胞类型特异性高表达的基因进行富集分析，该分析有助于解析角膜缘微环境细胞的调控机理。结果发现如角膜缘上皮细胞富集到的term有：epidermis development、epithelial cells differentiation和cornified envelope assembly等（Figure 1F）。
2.角膜缘上皮细胞的三个区域亚群特征描述
Figure 2. 角膜缘上皮细胞进一步亚群分析
为了进一步解析角膜缘上皮细胞的异质性特征，作者将角膜缘上皮细胞做亚群分析，结果共分为3个亚群。其中，sC0亚群高表达角膜缘基底上皮层位置的相关marker（Figure 2B中的basal layer），一般认为该位置中广泛存在角膜缘干细胞和角膜缘前体细胞，而sC0中证实确实高表达角膜缘干细胞和前体细胞marker（TP63、ABCG2 和 FZD7等），因此，sC0被定义为角膜缘干/祖细胞（limbal stem/progenitor cells，LSPCs）。SC1高表达上基层markerGJA1（Figure 2B中的superbasal layer），被定义为LSbCs。同样，SC2高表达表层markerIVL（Figure 2B中的superficial layer），被定义为LSfCs。这样，作者成功将角膜缘上皮细胞分为三个区域亚型sC0-LSPCs、SC1-LSbCs和sC2-LSfCs。
接下来，作者从三个方面完善了上述结果：
1）免疫荧光对三个亚群进行定位（Figure 2D）；
2）对每个亚群高表达基因进行富集分析，从term功能上辅助验证（Figure 2E）；
3）通过scenic分析得到三个亚群的特征调控子，从TF和其下游靶基因功能和表达趋势上辅助判断亚群定位的准确性和相应的生物学功能特征（Figure 2F-G）。
3.LSPCs的四种不同亚型状态特征描述
Figure 3. LSPCs进一步亚群分析
考虑到SC0-LSfCs细胞数目比较多而且明显异质性比较强，为了探究LSPCs的异质性状态特征，作者对LSPCs进行进一步的亚群分析。依据相关的分子表达特征，结果共可将LSPCs分为四个亚型（Figure 3A-C）：
1）高表达经典的角膜缘干细胞marker TP63的TP63 + subcluster；
2）高表达趋化因子的CCL20 + subcluster；
3）高表达静息状态角膜缘干细胞marker GPHA2的GPHA2+subcluster；
4）高表达角质形成相关基因KRT6B 的KRT6B+subcluster。
为了进一步探究四个亚群的功能特征，作者从五个方面进行了实验和分析：
1）免疫荧光验证上述4个亚型的定位特征；
2）scenic分析鉴定四个亚型各自的典型调控子，从调控子本身功能解析亚型特征（Figure 3E），如TP63 + subcluster检出与维持干细胞潜能密切关联的ID1，CCL20 + subcluster检出与干细胞自我更新和分化密切关联的MYC；
3）对每个亚型高表达基因进行富集分析，从term功能上探究亚型功能（Figure 3G）；
4）细胞干性和分化能力打分，结果发现TP63 + subcluster和CCL20 + subcluster的干性更强，GPHA2+subcluster和KRT6B+subcluster的分化能力更强（Figure 3F）；
5）基于RNA velocity分析辅助验证了上述第四条结果，TP63 + subcluster基本处于静息状态，其次是CCL20 + subcluster，而GPHA2 + subcluster的RNA剪接速度较快，再之后是KRT6B + subcluster。
4.构建角膜缘上皮细胞分化轨迹
Figure 4. 构建角膜缘上皮细胞分化轨迹
为了构建角膜缘上皮细胞的分化轨迹，作者从两个方面进行了探究。首先是RNA velocity分析，如图Figure 4A，区域a显示较小的RNA速度（短或没有箭头），区域b位于LSPC 和LSbC中间，展现了较大的RNA速度，提示细胞分化的开始。区域c位于位于LSbC靠近LSfC，展现了更高的RNA速度水平，区域d位于LSfC，其RNA velocity速度有明显增高（箭头很长）。上述四个区域的RNA速率结果反映了角膜缘上皮细胞分化和迁移的动态过程。其次，作者基于monocle2分析构建了LSPC-LSbC-LSfC的发育轨迹（Figure 4B-C），并探究了轨迹变化中关键基因的变化轨迹（Figure 4D-G）。
5.LSPCs和微环境细胞间的通讯作用关系分析
Figure 5. 基于配体受体分析的角膜缘生态位调控
基于配体受体分析，作者构建了LSPCs和其微环境细胞的通讯关系网络。Figure 5A-C展示了细胞之间的关系对数目，结果发现LSPCs与其他细胞间的作用关系紧密。与LSPCs通讯最紧密的是基质细胞（Figure 5D），与先前报道的人角膜缘干细胞生态位中强烈的上皮-基质相互作用一致。此外，作者分析了一些明星通路中相关配体受体在LSPCs中的表达情况。如Notch通路，LSPCs中广泛检出受体NOTCH1-4，对应的配体在周细胞、基质细胞、雪旺氏细胞和LSPCs中广泛检出，表明Notch信号通路参与了LSPCs细胞内和微环境细胞之间的通讯作用关系（Figure 5E-I）。
6.角膜免疫赦免和血管生成赦免的分子作用特征分析
Figure 6. 角膜缘和皮肤免疫赦免和免疫排斥相关基因分析
在该部分的分析中，作者重点探究角膜缘细胞群体中免疫赦免和血管赦免相关基因的表达特征。第一部分是关于免疫赦免的相关分析，作者首先探究了不同细胞类型中免疫赦免相关基因的表达特征分析（Figure 6A），结果发现免疫赦免相关基因在各个细胞类型中呈现“分散式表达”，即多个细胞类型均有相关免疫赦免基因的高表达。同样，对于免疫排斥相关基因，结果发现MHC II相关基因主要在DC中表达（Figure 6B）。Figure 6D-G展示了皮肤样本和角膜样本免疫赦免和免疫排斥相关基因的表达差异，结果发现相对有皮肤样本，角膜免疫细胞高表达IDO1和CD274等免疫赦免相关基因，而免疫排斥MHC相关基因则表达量较低。因此相对于皮肤，角膜免疫细胞表现出更明显的免疫抑制能力。同理，作者对血管赦免进行了类似的分析内容。
欧易点评
本篇文章是典型的单细胞图谱形式文章，文章最主要的亮点是角膜缘上皮细胞发育轨迹的构建以及角膜缘干细胞的功能特征分析。在分析手段上，本篇文章尤其在拟时序分析、RNA velovity分析、细胞通讯分析和scenic分析的运用上具有很好的参考意义。
文献链接
PMID: 33964410
DOI: 10.1016/j.jtos.2021.04.010
