基本信息
材料：原发及早期复发性肝细胞癌肿瘤及配对癌旁组织
期刊：Cell
方法：MIRALCS, 10x Genomics
影响因子：38.635
研究目的：描述原发及早期复发性 HCC 肿瘤微环境特征
研究背景
肝癌是全球癌症相关死亡的第四大原因，肝细胞癌（HCC）是肝癌的最主要形式。目前对于肝癌的治疗手段通常是手术切除，但较高的术后复发率大大降低了患者的生存率，尤其是术后 2 年内的早期复发占整体 HCC 复发病例的 70%。本研究中作者通过单细胞转录组测序对原发及早期复发性 HCC 患者的肿瘤微环境进行深入探索，试图发现更有效的治疗策略。
实验设计
作者收集了 12 例原发和 6 例早期复发性 HCC 患者的肿瘤样本和配对癌旁组织（原发肿瘤样本 PT，原发癌旁 PNT，早期复发性样本 RT，早期复发癌旁 RNT）。由于不同样本之间存在免疫浸润水平的差异，作者采用 FACS 分选了 CD45+ 和 CD45- 细胞，将两者以 3:1 的比例混合后进行单细胞全长转录组测序。针对质控合格的 16,498 个细胞进行后续分析。此外，作者还另外收集了样本作为验证队列来对相关结果进行补充和验证（验证队列 1: 4 例患者的配对原发肿瘤和复发肿瘤；验证队列 2: 47 例患者的配对原发肿瘤和复发肿瘤）。
技术路线示意图
研究内容
1. 早期复发性 HCC 肿瘤微环境细胞图谱
针对质控合格的细胞进行 tSNE 降维及无监督聚类，共得到 24 个 clusters，使用 marker 基因进行细胞类型注释，鉴定到非免疫细胞包括内皮细胞、肝星状细胞、正常上皮及恶性肿瘤细胞等，免疫细胞包括髓系细胞、T 细胞、B 细胞、浆细胞和 NK 细胞等（Fig. 1CD）。这些细胞类型在不同患者中均存在，但细胞占比却大不相同（Fig. 1EF）。
Fig. 1 原发及早期复发性 HCC 患者肿瘤微环境
2. 早期复发性 HCC 肿瘤组织具有独特的免疫微环境
作者将 myeloid cells 和 NK/T 细胞分别进行二次降维，进一步分析不同的亚群特征。
2.1 针对 myeloid cells，亚群分析后得到 11 个 clusters，包括 5 群巨噬细胞、2 群单核细胞、3 群树突细胞及一群循环细胞（Fig. 2A-2C）。其中不同病人之间 DC 的比例变化最为明显，早期复发性患者样本（RT 和 RNT）中 DC 比例均高于原发患者的样本（PT 和 PNT），随后作者通过免疫组化验证了这一结果（Fig. 2D-F）。
Fig. 2 原发及早期复发性 HCC 中 myeloid cells 亚群特征
2.2 NK/T 细胞亚群分析。将 NK/T 细胞进行亚群分析得到 17 个 clusters，通过 marker 基因对细胞亚群进行注释并详细描绘了各亚群的功能特征。NK 细胞可以分为 NK CD16、NK CD160 两个亚群，NK CD160 低表达 FCGR3A，作者认为可能是组织驻留型记忆 NK 细胞，且在本研究中主要在癌旁（PNT, RNT）样本富集；NK CD16 高表达 FCGR3A，暗示这群 NK 细胞主要从外周血中招募而来，高表达一些细胞毒性基因，如 GNLY, GZMB 和 PRF1 等，表明外周血是肿瘤浸润 NK 细胞的主要来源。
CD4+ T 分为 CD4 CCR7、CD4 IL2、Treg FOXP3和 Treg LAYN 4 个亚群，其中 Treg FOXP3 高表达 CD27、FOXP3、LAIR2 等基因，主要在肿瘤中富集，尤其在 PT 样本中占比较高；CD8+ T可分为 CD8 CCR6、CD8 NR4A1、CD8 GZMK、CD8 XCL1、CD8 CTLA4、CD8 LAG3 等 7 个亚群，尽管 CD8+ T 的各个亚型在 RT 与 PT 样本中并无较大差别，但总的 CD8+ T 在 RT 中的占比要高于 PT 样本（Fig. 3E），因此作者后续也重点针对 CD8+ T 进行了探究。除上述细胞亚型外还有一群 cluster 高表达细胞周期相关基因，注释为 cycling T 细胞（Fig. 3C）。
综上所述，早期复发性 HCC 中存在独特的免疫景观，与原发患者样本相比，早期复发性 HCC 样本中 DCs 比例增加，Tregs 减少，T 细胞增殖减少，CD8+ T 细胞增加。
Fig. 3 NK/T 细胞亚群
3. 原发及早期复发 HCC 中 CD8+ T 的不同状态
为了探究 CD8+ T 在原发及早期复发性 HCC 样本中的状态转变，作者对 CD8+ T 进行拟时序分析，并对轨迹中的细胞进行毒性及耗竭特征打分（Fig. 4AB）。对轨迹中 CD8+ T 细胞的来源进行分析发现，RT 样本中的 CD8+ T 主要分布在轨迹的前端，而 PT 样本中的 CD8+ T 大多处于轨迹末端，表现出细胞毒性及耗竭状态（Fig. 4C）。接着作者进一步研究拟时序过程中的转录特征，整个变化过程可分为 4 个时期，phase1 的细胞以 CD8 CCR6 、CD8 NR4A1 为主，其特征为低表达细胞毒性基因，富集分析表明该群细胞主要参与脂质和脂蛋白代谢、转化生长因子 TGF-β 受体信号通路等；phase2 的细胞基因表达特征与肝脏驻留记忆细胞类似；phase3 高表达细胞毒性基因，低表达 T 细胞耗竭标志物。随后进入 phase4，其高表达 T 细胞耗竭相关 TFs 的特征进一步证实这些细胞的耗竭状态（Fig. 4D-G）。
PT 和 RT 样本中的 CD8+ T 细胞呈现相同的转移轨迹，但其免疫和转录状态存在显著差异，提示原发性和复发性肝癌的治疗应考虑不同的免疫治疗策略。
Fig. 4 CD8+ T 拟时序分析
4. CD8+ T 细胞在早期复发性 HCC 独特的转录特征
接下来作者对 RT 样本中 CD8+ T 独特的转录特征进一步探究。研究发现 RT 样本中 CD8T 与 PT 样本中的衰竭状态不同，RT 样本的 CD8+ T 过表达 KLRB1，表现出先天样功能障碍状态，且具有低的细胞毒性和免疫抑制表型。值得注意的是，在复发和原发性肝癌中，KLRB1 高表达的 CD8+ T 细胞中相关基因的富集与肿瘤的不良预后相关（Fig.5）。
Fig.5 复发性 HCC 中 CD8+ T 细胞独特的免疫表型
5. 早期复发性 HCC 中的 CD8+ T 的克隆扩张
接下来，作者探究了 CD8+ T 细胞的克隆扩张情况。研究发现 RT 和 RNT 样本之间 CD8+ T 细胞几乎未发生克隆扩增情况（Fig.6B），该结论通过 bulk 水平的 TCR-seq 进一步证实。因此作者认为 CD8+ T 细胞克隆在 RT 中处于低增殖和无应答状态，造成此现象的部分原因是肿瘤选择，提示在复发性 HCC 中，这些细胞不能消除带有亚克隆新抗原的复发肿瘤细胞。
Fig. 6 CD8+ T 细胞在复发性 HCC 中的克隆扩增
6. 恶性细胞在早期复发性 HCC 肿瘤微环境中独特的作用
以上针对 HCC 肿瘤微环境中免疫细胞的分析表明，复发性 HCC 与 Treg 比例降低、巨噬细胞未增殖或者其他 T 细胞亚型的免疫抑制作用有关，由此作者认为 PT 和 RT 之间肿瘤生态系统的实质性差异可能是由恶性细胞引起的。对 PT 与 RT 中的恶性细胞进行组间差异及富集分析，结果显示 PT 中的基因主要富集到细胞周期相关通路的基因（如 MYC_targets_V1 和 G2M_checkpoint 通路），而 RT 中上调的基因主要富集到免疫应答通路（如 INF_gamma signaling，TNFA_signaling_via_NFKB）（Fig. 7A），表明 RT 具有低增殖能力和高免疫逃逸能力。复发性恶性细胞可通过 PD-L1-CD80 和 CTLA4-CD80 轴破坏 DC 细胞的抗原递呈，并通过 CCL20-CCR6 轴招募先天性 CD161+ CD8+ T 细胞，从而在早期复发的 HCC 中形成功能失调的抗肿瘤免疫。
Fig.7 肿瘤微环境中恶性细胞的特征
总结
本研究作者通过 scRNA-seq 揭示早期复发性 HCC 的独特免疫特征：早期复发性 HCC 中，Tregs 减少，DCs 增加；CD8+ T 细胞表现出先天样功能障碍状态，具有低细胞毒性和低克隆扩增表型；RT 具有低增殖能力和高免疫逃逸能力。复发性恶性细胞可通过 PD-L1-CD80 和 CTLA4-CD80 轴破坏 DC 细胞的抗原递呈，并通过 CCL20-CCR6 轴招募先天性 CD161+ CD8+ T 细胞，从而在早期复发的 HCC 中形成功能失调的抗肿瘤免疫。本研究结果为进一步提升肝癌免疫治疗的疗效和寻找有效肝癌复发转移防治新策略提供更多理论依据和实验证据。
参考文献
Sun Y , Wu L , Zhong Y , et al. Single-cell landscape of the ecosystem in early-relapse hepatocellular carcinoma[J]. Cell, 2020, 184(2).
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