大部分针对核酸的研究都需要对核酸进行定量。常规的核酸定量原理、相关技术及仪器大家都很清楚，今天我们就来说说对少量核酸进行定量时会遇到的情况。
一、 检出限和定量限
首先，由于目前检测手段的限制，当核酸量比较少的时候，核酸定量的准确性是比较难保证的。
各种检测手段都有检出限和定量限，检出限通俗讲就是当物质达到一定量时，某种特定的仪器或检测手段才能检测到；定量限是指在物质达到一定量之后，测定值较接近真实值。定量限也是一个范围，最低值大于检出限的最低值，最高值小于检出限的最高值。
二、几种核酸定量方法及准确性
1. Nanodrop法
Nanodrop的检测原理是紫外吸收，其中Nanodrop 2000这款仪器宣传的检出限是2ng/μl-15000ng/μl（dsDNA），其中当核酸浓度在2~100ng时，SD±2 ng/ul；如果样本浓度高于100ng/μl，CV值为±2% 。另外Nanodrop方法无法区分DNA和RNA，也无法区分单核苷酸和核酸链。所以如果DNA样本中混了RNA或者RNA中混了DNA，核酸短链或核苷酸单体的大量存在都会导致检测值虚高，影响真实浓度的测定。
图1 Nanodrop 2000检测流程图
图2：核酸检测紫外吸收峰图 图3：核酸及不同杂质紫外吸收峰图
2. Qubit法
Qubit的原理是利用荧光染料结合在DNA或RNA分子上发出荧光，再对荧光强度进行测定从而得到核酸的浓度。该方法的准确性比较高，而且因为DNA和RNA的检测分别使用不同的染料，因此能够区分样本中的不同分子，但是这种方法对原始样本的浓度要求比较高，对DNA的检测一般需要原始样本浓度大于0.2ng/μl，如果低于这个浓度检测可能会显示too low。而对于RNA的检测，则需要原始样本的浓度高于5ng/μl可进行相对准确的检测，当样本浓度低于5ng/μl时，就已经测不出浓度了。所以Qubit方法不适合进行低浓度样本的检测。
图5：Nanodrop和Qubit浓度检测偏差和变异系数
当核酸浓度很低时，无论是用Nanodrop还是用Qubit，其测定结果准确性都比较低。图5是Thermofisher给出的Nanodrop ND-1000和Qubit检测低浓度样本时会出现的偏差和变异系数统计结果。从统计结果可见，DNA浓度越低，其偏差和变异系数越大，不过Qubit的偏差和变异系数均小于Nanodrop。
3. Bioanalyzer 2100法
有些项目由于各种条件限制，客户能提供的样本量非常少，所以抽提得到的RNA总量相应的也很少，无法使用Qubit定量，而使用Nanodrop定量的结果又不准确。这时候我们大多采用安捷伦的Bioanalyzer 2100给出的浓度参考值。
Bioanalyzer 2100对核酸进行定量是基于荧光光度法，它能够同时给出条带和浓度信息。利用已知片段大小的Ladder，生成迁移时间与片段大小的标准曲线，即可通过不同迁移时间来确定样品的片段大小。通过样品峰面积对已知浓度的Marker或Ladder面积的比值来对样品进行定量。如果样本量浓度很低，检测系统给出的参考值的准确性也比较低。举例来说，使用同一份血浆，分别取2ml和4ml进行外泌体的分离并抽提RNA，对RNA进行2100质检，仪器给出的浓度值不一定是2倍关系。这主要是因为样本量太低，检测结果的偏差太大导致的。
图6：2100质检DNA峰图及模拟胶图
图7：2100质检RNA峰图及模拟胶图
4. 4200法
4200也是一种常用的核酸片段检测仪，原理与Bioanalyzer 2100不完全相同，用这两种仪器对同一份样本进行检测所得到的浓度值差异是比较大的，通常4200给出的浓度参考值是2100给出的浓度参考值的数倍之多。如图8所示的同一份样本分别用4200和2100质检，两个样本的浓度分别相差11.79和8.93倍。
图8：4200（左）和2100（右）质检相同两个外泌体RNA样本
三、 其他影响因素
除了检测方法本身的影响，还有一个因素是现在所使用的大部分检测仪器上样量体积非常小，通常是1-2μl。根据Thermofisher公司提供的一份资料显示，使用的移液器的量程范围，吸液的方式及吸取的样本体积对检测都有影响。所以为了保证检测准确性，使用合适量程的移液器，合适的吸液方式及增加检测样本的体积可以有效提高检测的准确性。
图9：移液器正向吸液方式 图10：移液器反向吸液方式
图11：不同量程移液器及检测体积的差异对CV值的影响
由此可见，当样本量比较低时，要对样本进行精确定量是比较困难的。这也是很多人在做少量或微量样本时会经常遇到的问题：为什么提供了更多的样本量，得到的RNA反而少了？为什么同样的送样，两次定量的结果差了好几倍？为什么两份RNA等体积合并后，浓缩到合并后体积的一半再质检浓度依然没有增加？这些都是因为量少，测量误差太大导致的。