2024年4月24日，浙江大学医学院附属第一医院的郑祥毅、罗金旦及刘犇教授团队在Molecular Cancer杂志（IF=37.3）发表题为“Co-transcriptional R-loops-mediated epigenetic regulation drives growth retardation and docetaxel chemosensitivity enhancement in advanced prostate cancer”的文章，本文总结了N6-腺苷酸甲基化（m6A）在表观遗传调控中的新作用，介绍了IGF2BP蛋白以m6A依赖的方式介导R环代谢，这可能导致前列腺癌（PCa）的生长迟缓和多西他赛化疗耐药，强调了IGF2BP作为表观遗传R环阅读器在转录遗传调控和癌症生物学中的功能重要性。此外，该研究提供了一种新的RBM15/IGF2BPs/DNMT1反式组学调控m6A轴，阐明了PCa中RNA m6A甲基化和DNA甲基化之间存在新的联系。
发表期刊：Molecular Cancer
影响因子：37.3
涉及的欧易生物服务产品：850k甲基化芯片（MethylationEPIC BeadChip）
R环是一种经常在转录过程中形成的三链核酸结构，包括一个DNA-RNA杂交和一个置换的单链DNA，可能与基因组的稳定性和基因表达调控有关。研究发现RNA修饰有助于维持R环的稳定性，如m6A。然而，人们对m6A修饰的R环在调控基因转录中的作用仍然知之甚少。
本文证明了胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（IGF2BPs）以m6A依赖的方式识别R环。IGF2BPs过表达通过阻止DNA甲基转移酶1（DNMT1）与信号素3 F（SEMA3F）启动子的结合，导致PCa中整体R环水平增加、细胞迁移抑制和细胞生长迟缓。SEMA3F过表达通过调节Hippo通路显著提高了PCa中多西他赛的化学敏感性。本研究指出了一个由IGF2BPs介导的R环代谢途径，强调了IGF2BPs作为表观遗传R环阅读器在转录遗传调控和癌症生物学中的功能重要性。
1. PCa中R环减少并招募IGF2BP蛋白
本研究发现PCa癌旁组织中R环的丰度高于癌组织。用质谱法检测R环抗体拉下的蛋白，发现蛋白主要参与各种RNA加工过程，包括mRNA的剪接、降解和稳定。其中，IGF2BP家族是已知的m6A阅读器，而m6A对R环的代谢至关重要。通过IP实验证实IGF2BP可以和R环物理结合，免疫荧光法也检测到它们的共定位。综上数据表明IGF2BPs蛋白可能是一组关键的R环调控因子。
图1 PCa中R环减少并招募IGF2BP蛋白
2. IGF2BPs优先结合含有m6A修饰的DNA:RNA杂交体，并导致R环积累
通过RNA pull-down并结合质谱检测，发现IGF2BP蛋白优先结合含有m6A修饰的DNA:RNA杂交体。在IGF2BPs过表达细胞中，R环水平显著升高，而m6A去甲基化会逆转这一现象。综上表明IGF2BP过表达导致PCa细胞中R环以m6A依赖的方式积累。值得注意的是，YTHDF2过表达可以削弱IGF2BPs和含有m6A修饰的DNA:RNA杂交体的结合，IGF2BPs过表达也影响了YTHDF2与细胞核中R环的共定位。综上，IGF2BP可能通过阻止YTHDF2与R环的结合来调控R环。
图2 IGF2BPs优先结合含有m6A修饰的DNA:RNA杂交体，并导致R环积累
3. IGF2BPs过表达整体上调靶基因表达和启动子区域的R环水平
通过DRIP-seq结果发现，当IGF2BP过表达时，R环会积累，且整个启动子区域的R环信号增强，大多数转录本水平均显著升高，其中3个IGF2BP蛋白均发现了5个公认的R环靶基因。结合m6A DIP-seq结果，共同靶基因只有SEMA3F在R环区域包含一个m6A峰。值得注意的是，IGF2BPs过表达增加了SEMA3F启动子上R环的形成。通过qPCR检测，也验证了IGF2BPs过表达会引起SEMA3F表达上调。
图3 IGF2BPs过表达整体上调靶基因表达和启动子区域的R环水平
4. IGF2BP通过抑制DNMT1和YTHDF2来上调SEMA3F的表达
通过mepreses数据库发现，SEMA3F低表达的PCa患者的启动子区域甲基化水平明显高于高表达队列。随后进一步探究了SEMA3F与DNA甲基转移酶（DNMTs）之间的关系，发现DNMT1沉默会导致SEMA3F表达上调。染色质免疫共沉淀表明，DNMT1直接与SEMA3F的启动子结合，而IGF2BPs会抑制它们的结合。细胞实验也证实，IGF2BPs过表达降低了SEMA3F启动子的甲基化水平。此外，通过850k甲基化芯片检测结果，发现了IGF2BPs过表达改变了整体DNA甲基化模式，并伴随着CpG岛、shelves和shores的低甲基化。随后ChIP-PCR检测显示，IGF2BPs过表达下调了YTHDF2与SEMA3F启动子的结合，而YTHDF2沉默上调了SEMA3F的表达。综上结果表明，IGF2BP可以通过抑制DNMT1和YTHDF2来上调SEMA3F的表达。
图4 IGF2BP通过抑制DNMT1和YTHDF2来上调SEMA3F的表达
5. RBM15诱导R环的m6 A RNA甲基化
根据结果1的质谱鉴定结合IP结果，证实了R环与RBM15之间的相互作用，免疫荧光结果也证实二者的共定位。通过斑点印迹实验发现RBM15过表达显著上调了R环水平和m6 A修饰。此外，通过MeDIP-PCR和reChIP-PCR检测，发现当RBM15表达上调时，SEMA3F启动子上m6 A位点的甲基化水平发生了显著改变。值得注意的是，IGF2BP和RBM15过表达均显著抑制了细胞的迁移和增殖活力，而RBM15敲除可以部分逆转IGF2BPs的这一作用。这些数据表明，IGF2BP对PCa的抑制作用依赖于RBM15对R环的m6A修饰。
图5 RBM15诱导R环的m6 A RNA甲基化
6. SEMA3F在前列腺癌中起抑癌作用
SEMA3F作为IGF2BP的共同靶点，在PCa中也同样下调，且SEMA3F表达较低的个体预后明显较差。SEMA3F和RBM15过表达显示出激活Hippo通路、减弱肿瘤发生、血管生成和组织生长的特殊能力，且过表达组的多西他赛化疗敏感性发生了显著变化。总之，本研究发现了RBM15和IGF2BP通过调控SEMA3F介导的Hippo通路在PCa中发挥抑癌作用。
图6 SEMA3F在前列腺癌中起抑癌作用
1、证明了IGF2BP可以以m6A依赖的方式调节R环代谢，且更倾向于结合含有m6A修饰的DNA:RNA杂交体，其中KH结构域对于IGF2BP和R环的结合至关重要。
2、发现了RBM15负责R环的m6A修饰，提供了一种新的RBM15/IGF2BPs/DNMT1反式组学调控m6A轴，表明PCa中m6A和DNA甲基化之间存在新的关联。
3、SEMA3F作为IGF2BPs共同靶点，与PCa患者的生存相关，可能作为生物标志物来预测未来PCa的风险。
参考文献：
Ying Y, Wu Y, Zhang F, Tang Y, Yi J, Ma X, Li J, Chen D, Wang X, Liu X, Liu B, Luo J, Zheng X, Xie L. Co-transcriptional R-loops-mediated epigenetic regulation drives growth retardation and docetaxel chemosensitivity enhancement in advanced prostate cancer. Mol Cancer. 2024 Apr 24;23(1):79. doi: 10.1186/s12943-024-01994-0.
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