有机酸含量，特别是苹果酸和柠檬酸盐的含量是影响水果口感和营养价值的主要因素，由野生酸枣驯化而来的栽培枣中有机酸含量大幅下降，果实风味多样性降低。
2024年1月3日，山东农业大学张春梅研究团队和山东省果树研究所董肖昌研究团队在植物学权威期刊《Horticulture Research》上共同发表了题为“A natural mutation in the promoter of the aconitase gene ZjACO3 influences fruit citric acid content in jujube”的研究论文，探讨了ZjACO3在栽培枣和酸枣果实柠檬酸积累中的作用，阐明ZjACO3调节酸枣和栽培枣果实中柠檬酸的积累机制，为改善栽培枣风味多样性的分子育种提供了有效信息。
欧易生物对该项目的酵母文库构建提供了支持。
发表期刊：Horticulture Research
影响因子：8.7
发表日期：2024年1月
研究材料：89个酸枣果实和44个栽培枣果实，
研究内容：以ZjACO3基因为研究对象，对柠檬酸含量进行测定，并通过酵母单杂交筛选、瞬时双荧光素酶检测和过表达分析等实验方法，研究了ZjACO3的基因功能及其在枣果实柠檬酸的积累中的作用。
1. ZjACO3的表达与枣果中柠檬酸积累呈负相关
作者通过对89个酸枣和44个栽培枣果实柠檬酸含量进行定量分析发现，酸枣果实柠檬酸平均含量是栽培枣果实的5.57倍，栽培枣果实中的柠檬酸含量明显减少(图1A、B)，表明柠檬酸含量的降低是枣驯化过程中的重要性状。
为了评估栽培枣及其野生祖代酸枣中柠檬酸降解的遗传基础，作者对上述5个酸枣和5个栽培枣进行转录组数据分析，在栽培枣中发现一个显著上调的柠檬酸降解基因——ZjACO3，其基因表达水平与柠檬酸含量呈显著负相关。此外，与酸枣果实相比，两种异柠檬酸脱氢酶(IDH)、一种谷氨酰胺合成酶(GS)和一种谷氨酸脱羧酶(GAD)都位于柠檬酸降解途径的下游，在栽培枣中表现出更高的表达水平(图1C)。接下来作者通过RT-qPCR测定了ZjACO3在果实发育不同阶段和不同组织中的表达水平，发现ZjACO3在幼果中表达较弱，在果实着色阶段表达较强(图1D)；在栽培枣果实中含量丰富，在叶片中表达较弱(图1E)。此外，作者还发现ZjACO3在栽培枣中的相对表达水平是酸枣的三倍，与ACO酶活性检测结果一致(图F、G)， ZjACO3 mRNA丰度与柠檬酸盐含量显著相关(图1H)。
图1 酸枣和栽培枣中柠檬酸含量及ZjACO3的表达特征
因此，作者认为ZjACO3的表达与枣果实中柠檬酸盐含量呈负相关。
2. ZjACO3参与细胞质中的柠檬酸降解
为阐明ZjACO3对柠檬酸盐降解的影响，作者分别构建了IL60-ACO3(过量表达ACO3)和TRV-ACO3(沉默ACO3的表达)重组载体并侵染酸枣果实来调节ZjACO3的表达水平，以转入空载的枣果为对照，孵育5天后，过表达ZjACO3的枣果中柠檬酸盐含量降低，而干扰ZjACO3表达的枣果中柠檬酸含量显著提高，表明ZjACO3的表达能够增强柠檬酸降解。此外，作者还发现水果中苹果酸含量的改变与ZjACO3过度表达或沉默后观察到的柠檬酸盐含量的变化一致(图2A、B)。
图2 ZjACO3的瞬时表达
作者将ZjACO3基因在烟草叶片和拟南芥原生质体中瞬时表达，通过共聚焦显微镜观察发现，GFP荧光信号在细胞边缘受到大液泡的约束，绿色荧光蛋白与红色叶绿体之间存在重叠(图2C)，结合叶绿体的细胞质定位，推断ZjACO3-GFP也定位于细胞质内。接下来作者对柠檬酸降解通路中的相关基因进行鉴定，发现ZjACO3过表达后，ZjIDH1、ZjIDH2、ZjIDH3和ZjGAD1的表达水平显著升高；而ZjACO3沉默后，ZjIDH5和ZjGAD1的表达水平显著降低(图2D)。
因此，ZjACO3表达水平的变化影响了参与柠檬酸降解的下游基因的表达，柠檬酸可以通过细胞质中的GABA途径降解。
3. ZjACO3启动子突变会改变其表达，并与果实柠檬酸含量相关
为了研究ZjACO3的遗传结构，我们对23个栽培枣和34个酸枣的上游(5’)启动子的1200 bp进行测序，通过与ClustalW生成多序列比对来比较这些启动子序列，发现在不同的样品序列中检测到几个短插入/缺失或SNP，在所有检测到的突变中，栽培枣和酸枣样品之间的-484 bp(G/A)位置检测到一致的突变(图3A)，分为三种等位基因组合(G:G、A:A和A:G)，其中在酸枣中，“A”是主要基因型(81%)，在栽培枣中，“G”是主要存在基因型(86%)(图3B)。检测各基因型中柠檬酸含量发现，G:G基因型与低柠檬酸含量相关，A:A基因型与高柠檬酸含量相关，A:G基因型与中等柠檬酸含量相关(图3C)。对57份种质的基因型与柠檬酸含量进行相关性分析发现种质基因型与柠檬酸含量显著相关。
图3 鉴定与水果柠檬酸含量相关的ZjACO3启动子的三种基因型
接下来作者使用KASP标记对47个种质进行基因分型，将基因型聚类为三个簇，分别是A:A基因型，其中包括18个酸枣和2个栽培枣种质，是酸枣种质中的主要基因型；G:G基因型，包括1个酸枣和9个栽培枣种质，是栽培枣种质中的主要基因型；第三组是杂合子A:G基因型，包括14个酸枣种质和3个栽培枣种质(图3D、E)。
4. 转录因子bHLH113直接调控ZjACO3基因表达来促进柠檬酸盐的降解
接下来为了研究ZjACO3的作用途径，作者首先使用在线 JASPAR 数据库预测了可能与ZjACO3启动子区(GAGGTG和GAAGTG)结合的候选转录因子，结果表明，bHLH转录因子能够与含有GAGGTG的DNA基序结合。作者将突变区前后20 bp DNA片段(图4A)分别融合到pAbAi载体上构建诱饵菌株，通过Y1H文库筛选得到候选阳性克隆ZjbHLH113和ZjLHW，接下来作者利用一对一互作验证分析发现，在相同的AbA浓度下，用GAGGTG序列(栽培枣启动子SNP位点)转化的酵母细胞比用GAAGTG序列(酸枣启动子SNP位点)转化的酵母细胞长势更好；与ZjbHLH113一起孵育的酵母细胞比用ZjLHW孵育的酵母细胞生长得更快(图4B)。
此外，作者检测了ZjbHLH113、ZjLHW和ZjACO3在不同水果的各个发育阶段中的表达特征，发现ZjbHLH113与ZjACO3表达模式高度相似，而ZjLHW的表达在所有分析样品中均稳定(图4C)。因此，作者推测ZjbHLH113对栽培枣和酸枣果实中ZjACO3的差异表达至关重要。
图4 ZjbHLH113与ZjACO3启动子的互作分析
为了验证ZjbHLH113与ZjACO3的相互作用，作者通过荧光素酶报告基因分析，构建不同的启动子-LUC报告质粒，并将其与ZjbHLH113-62SK结合，在烟草中瞬时共表达，结果显示两种组合都表现出比阴性对照更强的荧光信号，在栽培枣中这种荧光信号强度更加显著(图5A)。这些结果表明，ZjbHLH113正向调控ZjACO3的表达，且在栽培枣中起的作用比在酸枣中更重要。
接下来作者采用瞬时遗传转化法修饰栽培枣中ZjbHLH113的表达水平来进一步验证ZjbHLH113对ZjACO3的调控作用，将pCAM2300::ZjbHLH13构建体侵染到枣果中，空载体作为对照，孵育5 d后发现ZjbHLH113的表达水平比对照高1.7倍，ZjACO3转录本丰度与对照组相比增加了0.8倍；与对照组相比，柠檬酸盐含量下降了30%(图5B)。
综上作者得出结论，ZjbHLH113通过调控ZjACO3的表达来促进柠檬酸盐的降解。
图5 ZjbHLH113与ZjACO3启动子的互作分析
在酸枣果实中，ZjbHLH113与ZjACO3启动子序列CAAGTG的结合能力较弱，导致ZjACO3转录本丰度低，阻碍细胞质柠檬酸的降解，促进柠檬酸在液泡中的积累。在栽培枣果实中，当启动子元件CAAGTG突变为CAGGTG时，ZjbHLH113直接与E-box元件CAGGTG结合，激活ZjACO3的转录，从而增强细胞质柠檬酸的降解，减少液泡中柠檬酸的积累。
图6 ZjbHLH113在栽培枣和酸枣果实柠檬酸积累中的作用模型
本研究得到了山东省国家自然科学基金（ZR2019BC029）、中国博士后科学基金（批准号：2019 M662416）、山东省重点研发计划（2023LZGC016）和山东省高校青年创意人才引进与培养计划：林木生物技术研究组的支持。