2月14日，同济大学附属同济医院消化内科主任杨长青教授团队在国际权威期刊Advanced Science（中科院一区Top，IF 15.1）以Research Article形式在线发表了题为“Myeloid-Mas Signaling Modulates Pathogenic Crosstalk among MYC+CD63+ Endothelial Cells, MMP12+ Macrophages and Monocytes in Acetaminophen-Induced Liver Injury”的论文，同济大学医学院博士生陈帅、清华大学自动化系博士后卢志、上海交通大学医学院博士生赵宇栋和同济大学附属同济医院夏璐医师为该论文的共同第一作者。

首次对进展期肝损伤（AILI）的免疫代谢微环境进行了单细胞层面的多维度解析，揭示了髓系Mas信号调控微环境中细胞间互作的关键分子机制，显著拓展了对AILI进展的理解，为未来发现新型药物干预靶点提供了方向。欧易生物为本研究提供了时空组学测序及分析服务。

发表期刊：Advanced Science

影响因子：15.1

涉及的欧易生物服务产品：单细胞转录组测序，空间转录组测序，转录组测序

药物性肝损伤(Drug-induced liver injury, DILI)是最常见的严重药物不良反应，也是全球范围内导致急性肝衰竭的首要原因。近年来，由于中药、抗生素、抗肿瘤药物的广泛使用，我国DILI疾病负担严重。解热镇痛药——对乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)所引起的肝损伤(APAP-induced liver injury, AILI)是DILI的一种常见类型，严重者需进行肝移植、甚至死亡。N-乙酰半胱氨酸是目前临床上唯一批准用于APAP过量的药物，然而其使用严重受限于治疗时间窗，凸显了在临床实践中开发替代或更有效治疗选择的迫切需求，因此深入探究AILI进展核心机制、寻找其他潜在药物干预靶点具有重要的临床意义。线粒体损伤、氧化应激及炎症反应是AILI进展的核心机制。N-乙酰半胱氨酸通过缓解氧化应激反应减轻肝损伤，但新近研究数据显示，调控“肝细胞外”免疫炎症反应可显著增加N-乙酰半胱氨酸的治疗获益。以往的AILI研究侧重探讨“肝细胞内”的损伤机制，而对肝脏炎症微环境中的细胞互作知之甚少，而这可能是AILI进展至急性肝衰竭的关键因素，因此，对AILI微环境进行全面且高分辨率的细胞表征可能有助于发现新的药物干预靶点。

本研究采用多种方法，包括scRNA-seq、空间转录组学技术等，在系统和细胞特异性水平上表征了Mas1缺陷小鼠的微环境。小鼠AILI模型的特征景观涉及MYC⁺CD63⁺内皮细胞、MMP12⁺ 巨噬细胞和单核细胞之间的相互细胞通讯，这种通讯通过增强的糖酵解和由于髓系Mas缺陷引起的NF-κB/TNF-α信号通路来维持。从ALF患者获得的样本中描绘了致病性微环境，证明了其临床相关性。以上发现极大地增强了对晚期AILI微环境的理解，并为患者分级和新治疗靶点的识别提供了潜在途径。

1. Mas缺陷小鼠AILI微环境中MYC⁺CD63⁺内皮细胞

在作者之前的研究中，已经使用小鼠AILI模型阐明了Mas信号激活在肝细胞中的作用。本文应用多组学分析和活体成像方法来研究Mas信号在小鼠AILI微环境中的作用（图1A）。通过评估CYP2E1和肝脏GSH的蛋白质水平，作者确定系统性Mas缺陷（Mas1^-/-小鼠）和AVE0991（一种Mas激活剂）的激活都不会对APAP代谢产生明显影响。人和小鼠DILI模型中肝内Mas表达显著上调（图1B），Mas的系统性缺陷加剧，而Mas的激活则改善了APAP诱导的肝脏炎症细胞浸润。作者使用数字自适应光学扫描光场相互迭代断层扫描（DAOSLIMIT）有效监活体小鼠中的肝中性粒细胞和单核细胞。随后，作者通过scRNA-seq鉴定出包括10种类型的26个细胞群，最终形成全面的高分辨率肝细胞图谱（图1C）。同时，将肝脏切片分成正常和受损区域，用于随后的空间转录组分析。为了整合scRNA-seq和ST数据，作者使用RCTD来解析不同spot的细胞组成。与WT-APAP组相比，Mas1^-/--APAP组表现出明显更大的损伤面积和更明显的炎症浸润。

图1 Mas缺陷AILI小鼠中MYC⁺CD63⁺EC的单细胞注释

内皮细胞是位于血管腔内最早感知损伤的细胞类型之一，在启动和推进损伤进展中发挥着关键作用。因此，作者最初分析了CD31⁺的内皮cluster。值得注意的是，EC7表现出包括Myc、Cd63和Il17ra的特异性表达，它们在Mas1^-/--APAP小鼠的肝脏中显著富集。作者采用MIA整合scRNA-seq和ST数据。值得注意的是，EC7仅存在于受损伤区域（图1E）。此外，EC7表现出显著的“促炎”特征，其中凋亡、坏死、NF-κB和TNF信号通路得分最高 。mIHC实验同样验证了CD31⁺ EC在Mas1^-/--APAP小鼠的肝脏中显富著集。此外，DAOSLIMIT提供了CD63⁺ EC在活体小鼠中肝脏分布情况（图1H）。基于CD105、CD146和LYVE1的共表达，MYC⁺ EC被进一步表征为肝窦内皮细胞（LSEC）。作者进一步通过GSVA来描述内皮细胞的功能特征。此前研究表明，一种MYC依赖性转录程序可以激活内皮细胞并将Ly6C⁺单核细胞募集到肝脏中。该研究发现CCR2⁺单核细胞和MYC⁺ EC之间存在一致的相关性（图1J）。使用KJ-Pyr-9对MYC进行药理学抑制，可以通过抑制CCR2⁺单核细胞的肝内浸润（而不是影响APAP代谢）从而显著改善了Mas1^-/--APAP小鼠的疾病表型。这一结果表明MYC依赖性单核细胞募集对疾病发病机制至关重要。

2. 内皮细胞来源的乳酸诱导糖酵解并使巨噬细胞极化为M1/M2混合表型

APAP过量与乳醛酸中毒、氧化应激和线粒体功能障碍有关。考虑到Mas对AILI小鼠肝细胞代谢的影响以及代谢状态对细胞功能的显著贡献，作者分析了主要依赖糖酵解的ECs的代谢特征。在所有簇中，EC7的糖酵解活性最高（图2A），其在EC分化轨迹中表现出显著上调。随后，利用mIHC来评估PKM和PFKFB3这两种糖酵解中的关键限速酶，在Mas1^-/--APAP组的MYC⁺ EC中的蛋白质表达（图2B）。考虑到EC产生大量糖酵解代谢产物的能力，特别是乳酸，它可以在局部巨噬细胞中诱导糖酵解，主要依赖于糖酵解作为其主要代谢途径，作者推测EC7可能在调节巨噬细胞的功能表型中发挥关键作用。因此，作者最初使用mIHC来确定MYC⁺ EC在空间上是否比中性粒细胞或T细胞更靠近巨噬。随后，作者根据巨噬的marker基因表达谱鉴定了七个不同的cluster。值得注意的是，以表达Mmp12和Mmp13为特征的C5（Mψ5）的存在在Mas1^-/--APAP组中显著富集，但在AVE0991给药后大幅减少（图2C，D），Mψ5的存在仅在ST的受损伤区域观察到（图2E）。Mψ5的结果与EC7的结果高度一致。基于包括Adgre1、Clec4f、Timd4和Mafb在内的kupffer细胞标记marker，Mψ5被进一步鉴定为kupffer细胞。此外，Mψ5表现出促炎表型。在本研究中，Mψ5被鉴定为表现出混合的M1/M2样表型，同时体现出M1和M2标记物的高表达水平。此外，流式细胞术分析显示，在Mas1^-/--APAP组中，共表达CD86（M1 marker）和CD206（M2 marker）的Mψ群体显著增加。此外，Mψ5同时表达促炎因子和促血管生成因子。值得注意的是，DAOSLIMIT揭示了Mas1^-/--APAP组中CD86⁺ CD206⁺ 巨噬细胞的肝脏富集（图2H）。此前研究表明内皮细胞可以产生乳酸，从而触发相邻巨噬细胞的糖酵解，并使其极化为M1/M2混合表型。此外，scRNA-seq代谢分析显示，糖酵解相关途径在Mψ5中富集程度最显著（图2I）。通过MMP12⁺ Mψ细胞中PFKFB3蛋白表达水平的mIHC评估进一步证实了这一点。此外，MYC药理学抑制后，表现出肝脏MMP12⁺ Mψ的显著降低，强调了MYC信号在维持该特定群体中的关键作用，并表明EC7和Mψ5之间潜在的细胞间通讯。LSEC条件培养基（CM）中的kupffer细胞表明糖酵解与M1/M2混合表型之间存在相关性（图2J、K）。此外，单羧酸转运蛋白抑制剂，α-氰基-4-羟基肉桂酸，可以有效逆转kupffer细胞中CM诱导的糖酵解，表明乳酸盐细胞摄取在CM中的关键作用。

为了阐明糖酵解在小鼠AILI中EC中的参与，作者构建了Cdh5^crePkm^f/+小鼠。值得注意的是，与Pkm^f/f-APAP小鼠相比，Cdh5^crePkm^f/+小鼠的肝损伤显著改善，对APAP代谢没有任何明显影响（图2L）。糖酵解抑制剂3PO通过拮抗PFKFB3有效改善了Mas1^-/--APAP小鼠的疾病表型，导致肝脏MMP12⁺ Mψ和MYC⁺ EC减少（图2M）。这揭示了糖酵解依赖性细胞crosstalk对AILI发病机制的潜在贡献以及对APAP代谢产生的显著影响。

3. 单核细胞来源的TNF-α通过TNFR1调节MYC⁺ CD63⁺ EC

内皮细胞的功能表型可能受到微环境因素的影响。因此，作者进行了CellphoneDB分析，以研究MYC⁺ EC和肝脏免疫细胞之间的相互作用。重要的是，WT-APAP小鼠的scRNA-seq和ST分析都揭示了EC7、Mψ5和单核细胞之间的显著相互作用。为了进一步阐明细胞与EC7相互作用的解剖学基础，作者使用ST数据将EC7定位点分类为intra-spots（表示最近的相互作用）、inter-spots（表示二次接近）或distant spots（最小的相互作用）。作者发现EC7细胞与Mψ5和单核细胞之间存在密切的相互作用（图3A）。这表明单核细胞可能参与Mas1^-/--APAP小鼠内皮细胞的表型转变。因此，使用氯膦酸盐脂质体消耗Mas1^-/--APAP和WT-APAP小鼠的kupffer细胞和单核细胞，导致肝损伤显著减轻，同时肝脏MYC⁺ EC数量减少（图3C）。随后，作者在WT-APAP和Mas1^-/--APAP组中使用cenicriviroc（一种CCR2/CR5双重拮抗剂）选择性抑制单核细胞向肝脏的浸润。Cenicriviroc不仅显著改善了AILI表型，还减少了两组之间的差异（图3D）。以上结果证明了单核细胞对Mas1^-/--APAP小鼠疾病表型的作用。

随后，作者使用配体受体（L-R）分析来研究三种细胞相互作用。研究结果表明，EC7和Mψ5通过CCL2-CR2介导单核细胞募集到肝脏中，而单核细胞通过Tnf-Tnfr1和Vegfa-Kdr与EC7相互作用。上述L-R对在Mas1^-/--APAP组中出现显著富集（图3E）。Kdr（VEGFR2）在EC7中的表达显著上调，其增殖率显著增加，如mIHC结果所示。CCR2⁺ 单核细胞也在损伤区域富集，表明它们与VEGFR2⁺ MYC⁺ EC的增殖有关。接下来，在Mas1^-/--APAP小鼠中给予西地尼布（一种VEGFR抑制剂）显著改善了肝损伤，减少了肝脏MYC⁺ EC群，同时对APAP代谢没有影响（图3F、G）。此外，单核细胞中TNF和NF-κB信号通路的表达随时序轨迹上调，表明单核细胞和EC7之间通过TNF-TNFR1的相互作用增强。此外，作者还研究了单核细胞来源的TNF-α是否诱导了EC7的出现。为了模拟体内微环境，作者将原代LSEC与骨髓源性巨噬细胞CM（BMDM-CM）孵育。BMDM-CM可以显著的诱导MYC⁺ CD63⁺ LSEC，其通过PFKFB3和PKM的表达表现出高的糖酵解活性（图3H–J）。mIHC分析显示，损伤区MMP12⁺ Mψ、CCR2⁺ 单核细胞和MYC⁺ EC之间存在高度的空间接近性，特别是在Mas1^-/--APAP组中（图3N）。

4. 髓系Mas缺失可以在AILI小鼠中维持促炎状态和糖酵解的微环境

为了进一步阐明Mas如何调节AILI微环境，作者构建了多个细胞特异性的Mas1敲除小鼠并用APAP处理。其中髓系Mas信号缺失小鼠的AILI表型显著加重，MYC⁺ EC和MMP12⁺ Mψ在其中表现出显著富集，以上结果证明了髓系来源Mas在调节AILI微环境中的意义。作者同时在AILI的早期（3和6小时）和晚期（24小时）施加了更高剂量的APAP，值得注意的是，在AILI的晚期（24小时），在髓系Mas缺陷小鼠中观察到疾病表型加重，以及MYC⁺ EC和MMP12⁺ Mψ富集的特征性微环境，这表明髓系Mas缺陷通过调节炎症微环境加剧晚期AILI的肝损伤，而不是在早期阶段影响细胞死亡。重要的是，单细胞代谢分析显示EC（C2/4/6）和Mψ（C1/2）的糖酵解活性显著升高，mIHC结果也进一步证实了这一点。此外，糖酵解的抑制有效改善了在髓系Mas缺陷小鼠中观察到的AILI表型，从而突出了糖酵解在AILI微环境中的关键作用。总的来说，髓系Mas信号通过影响促炎程度和糖酵解微环境来调节小鼠的肝损伤表型。

图4 髓系Mas信号通过高度促炎和糖酵解微环境调节AILI

5. 髓系Mas信号通过NF-κB/TNF-α途径调节AILI微环境

为了揭示髓系Mas如何调节AILI微环境，作者最初对scRNA-seq与bulkRNA-seq进行了分析比较，结果显示，髓系Mas的缺失后NF-κB和TNF信号通路显著上调，免疫荧光与WB等结果同样证明了这一点，体外施加AVE0991则会显著下调NF-κB和TNF信号通路，并抑制BMDM中TNF-α的产生。为了确定临床相关性，作者分离人外周血单核细胞（CD14⁺）进行bulk RNA-seq分析。AVE0991对人类单核细胞中的NF-κB和TNF信号通路表现出显著的抑制作用。随后，作者使用TNF-α抑制剂和R-7050（一种TNFα受体拮抗剂）调节髓系Mas缺失小鼠体内TNFα的功能。值得注意的是，两种抑制剂都表现出显著的肝保护作用，通过消耗AILI的特征性微环境，从而减轻肝损伤。综上所述，髓系Mas信号通过NF-κB/TNF-α途径调节AILI微环境。

图5 髓系Mas通过NF-κB/TNF-α途径调节AILI微环境

6. 小鼠AILI微环境与人类DILI微环境高度相关

DAOSLIMIT是一种新型扫描光场显微镜，作者利用DAOSLIMIT在活体小鼠的肝脏中观测到CD63⁺ EC细胞和Ly6C⁺ 单核细胞之间存在持续互作，为随后对微环境进行深入研究提供了重要基础。值得注意的是，由内皮细胞亚群、巨噬细胞亚群和单核细胞组成的特征性微环境也通过DAOSLIMIT活体亚细胞长时程动态成像技术在小鼠活体肝脏内进行直接观测。此外，AILI小鼠模型中所发现的，由髓系Mas信号所驱动的特有免疫代谢微环境，在DILI相关急性肝衰竭患者的肝脏样本中也得到映射，这一部分结果证明了基于其特征微环境识别高级人类DILI的潜力。

图6 DAOSLIMIT在活体小鼠中观察到的AILI微环境特征与人类DILI进展强相关

本研究对进展期AILI的免疫代谢微环境进行了单细胞层面的多维度解析，揭示了髓系Mas信号调控微环境中细胞间互作的关键分子机制，显著拓展了对AILI进展的理解，为未来发现新型药物干预靶点提供了方向。

原文链接：

Chen S, Lu Z, Zhao Y, Xia L, Liu C, Zuo S, Jin M, Jia H, Li S, Zhang S, Yang B, Wang Z, Li J, Wang F, Yang C. Myeloid-Mas Signaling Modulates Pathogenic Crosstalk among MYC+ CD63+ Endothelial Cells, MMP12+ Macrophages, and Monocytes in Acetaminophen-Induced Liver Injury. Adv Sci (Weinh). 2024 Feb 13:e2306066. doi: 10.1002/advs.202306066. Epub ahead of print. PMID: 38350725.

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