每种生物都有如指纹般独特的微生物特征。对于法医调查人员来说，所谓的“尸体微生物群”（necrobiome），即生活于腐烂尸体内部、表面和周围的微生物群，是腐烂过程中的一个核心角色，也是关键信息源。法医调查人员可以对尸体中的样本进行取样，根据微生物种群的构成推断一个人死亡的时间。那么今天和大家谈谈法医领域中一个潜力无穷的“黑科技”，在法医领域当中真可谓是大有用处。
2024年7月6日，复旦大学法庭科学研究院在Scientific Data（IF=5.8）发表题为“16S rRNA，metagenomics and 2bRAD-M sequencing to decode human thanatomicrobiome”的研究论文，该研究揭示了16S rRNA测序是尸体分解早期会首选的方法，而对于分解后期的尸体组织，2bRAD-M简化微生物组比宏基因组测序能更有效地克服宿主污染，可以促进对死亡微生物组的深入研究。
发表期刊：Scientific Data
影响因子：5.8
涉及的欧易生物服务产品：2bRAD-M简化微生物组、16S rRNA测序、宏基因组测序
微生物在尸体分解过程中起着重要作用，在法医学中具有重要意义。但这些研究主要集中在动物尸体，特别是肠道、皮肤和埋葬环境。目前对人体尸体死亡微生物的组成研究还不够充分，特别是在尸体高度腐烂的情况下，没有相关参考数据。
目前，综合人类微生物组计划已经对人类微生物群落在生命中的分布和功能进行了广泛的研究和应用。但在人体死亡后微生物群落仍会继续发生变化，这种变化过程被称为"死亡微生物组"。探索尸体不同阶段死亡微生物的群落结构和变化规律对法医学研究非常重要。
目前DNA测序技术的发展为解析不同环境中微生物群落结构和多样性提供了新的机会。16S rRNA测序是目前尸体微生物学研究中最常用的技术。然而，该技术的菌株分辨率较低，仅达到属水平，许多注释没有达到种水平。宏基因组测序覆盖整个微生物基因组，可实现种水平的鉴定，但是宏基因组应用到高宿主样本中仍具有挑战性。2bRAD-M简化微生物组是一项创新技术，能够以较高的准确性和灵敏度在种水平检测微生物。该技术也展示出在低生物量、严重降解或高宿主样品时的优势，但还没有该技术在死亡微生物组应用的报道。在这三种方法中，哪一种方法更适合死亡微生物组的研究尚不清楚。
1.探索不同技术方法(16S rRNA测序、宏基因组测序和2bRAD-M简化微生物组)分析人体死亡微生物组的适用性和优缺点。
2.本研究共分析了8具尸体、9个不同部位，包括口腔（oral）、鼻腔（nasal cavities）、心脏（hearts）、肝脏（livers）、脾脏（spleens）、肺（lungs）、肾脏（kidneys）、肌肉（muscles）和肠道（guts)的死亡微生物组。
3.三种技术方法在不同腐烂阶段有各自的优势，通过整合不同技术方法的数据，可提供一个更全面、可靠的死亡微生物组信息，为未来法医微生物学研究提供指导。
图1 研究技术路线
研究结果
1. 不同组织部位微生物群落组成
16S rRNA测序和宏基因组测序发现，死亡微生物组主要包含五个门：Bacteroidetes（拟杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Fusobacteria（梭菌门）和Proteobacteria（变形菌门），其中Firmicutes在所有样本组中最多。口腔组织的微生物多样性明显高于其他组织，不同组织间微生物群落存在显著差异。2bRAD-M简化微生物组显示Proteobacteria在不同组织中的丰度不同。
在属水平，16S rRNA 分辨率较差，许多物种被归为“其他”。宏基因组鉴定出了口腔组织中的核心微生物Streptococcus（链球菌）和Prevotella （普雷沃氏菌），鼻腔组织中以Bacillus（芽孢杆菌）和Klebsiella（克雷伯氏菌）为主，2bRAD-M简化微生物组显示Klebsiella在各个组织中广泛存在。
图2 Top 10微生物在门和属水平上的相对丰度 （a） 16S rRNA （b） 宏基因组 （c） 2bRAD-M简化微生物组
2. 不同组织部位物种的多样性分析
口腔组织在Chao1指数中表现出最高的微生物多样性，而鼻腔组织的物种均匀度明显较低。beta多样性分析表明，即使肺组织样本表现出较大的分散性，但来自同一组织的样本基本都聚集在一起。
图3 不同组织中微生物群落的α多样性分析（a）16S rRNA（b）宏基因组（c）2bRAD-M简化微生物组。两组上面相同字母表示它们之间没有显著差异。相反，它们之间存在显著差异
3. 差异物种分析
使用 Kruskal-Wallis 分析，Firmicutes（厚壁菌门）和Bacteroidetes（拟杆菌门）在所有技术中始终不同。在属水平上，16S rRNA 分辨率较低，多数检测被归类为“其他”和“未培养”。相比之下，宏基因组和2bRAD-M简化微生物组确定了Streptococcus（链球菌属）、Prevotella（普雷沃氏菌属）和Klebsiella（克雷伯氏菌属）是主要的不同属。Klebsiella pneumoniae（肺炎克雷伯菌）是各组中差异最大的物种。
图5 显著差异top10 物种丰度箱线图（a）16S rRNA（b）宏基因组（c） 2bRAD-M简化微生物组
研究结论
本研究通过2bRAD-M®简化微生物组技术分析了尸体中的微生物群落，并通过比较另外两种测序方法的优缺点，明确了2bRAD-M®简化微生物组技术在研究尸体后期腐败严重的样本时会更加有效，相较之下能够获得更多的微生物信息。同时，三种测序方法共同确定了尸体中的五大优势类群，并表明口腔组微生物物种组成与其他组织部位相比存在显著差异。测序方法的互相融合与这些发现都为未来法医微生物学研究的方法选择提供了指导意义。