为了探究TNT及其典型中间体（2-ADNT和4-ADNT）在厌氧与好氧条件下的微生物降解与降解机制，基于巴以冲突后加沙地带环境严重受污的现状，提示需开发高效修复技术。作者应用基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学技术，评估微生物菌株对污染物的耐受与降解能力，揭示其分子机制。本文旨在首次筛选出能高效降解TNT及其中间体的微生物，克服当前研究仅关注TNT降解而忽视中间产物毒性的局限，为环境修复提供新策略。

2024年8月，国民核生化灾害防护国家重点实验室习海玲、赵三平课题组在Journal of Hazardous Materials（IF：12.2）发表题为"Key genomes, transcriptomes, proteins, and metabolic factors involved in the detoxification/tolerance of TNT and its intermediates by bacteria in anaerobic/aerobic environments "的研究成果，该研究通过基因组学、转录组学、蛋白质组学与代谢组学综合研究方法，发现了厌氧-好氧环境中微生物菌株对TNT及其典型中间产物的高效降解特征，探究了其降解/耐受的分子机制，描绘了细菌代谢途径与能量稳态维持的图谱，为环境污染的生物修复提供了理论依据。欧易生物提供代谢组学检测及技术支持服务。

1、TNT及其降解中间产物的基本生理特性

为了探究蜡状芽孢杆菌在不同环境下对TNT及其中间产物的降解能力，并评估TNT暴露的影响，作者通过16S rRNA分析确认了菌种身份。实验发现，该细菌能快速降解TNT及中间产物，但TNT暴露显著抑制了好氧环境下细菌的生长，对厌氧环境下细菌生长则无显著影响。SEM和AFM观察揭示TNT暴露导致细菌细胞膜形态改变，表面粗糙度增加，EDS分析还显示元素分布不平衡。尽管FTIR显示官能团结构未受显著影响，作者仍表明TNT暴露对细菌细胞膜表面造成了一定损害。

图1.细菌降解TNT及其中间体的基本生理特性

2、模式菌株污染物降解/耐受的基因组图谱与关键表达基因

为了深入探究模式菌株对TNT及其中间产物的降解机制，作者首先进行了全面的基因组序列分析。结果显示，菌株基因组长度在7000-9000 bp之间，基因主要归属于芽孢杆菌类群，且降解污染物的关键基因集中在代谢、环境信息处理及遗传信息处理途径，特别是糖代谢、氨基酸代谢、ABC转运蛋白和双组分系统。

进一步地，作者通过测序数据预处理和基因覆盖度分析，评估了模式菌株在不同环境下对TNT及中间产物的降解基因表达。高质量数据覆盖度高达90-100%，在好氧和厌氧环境中，菌株分别表达了5943和5343个基因，差异显著。DEG分析揭示，好氧环境诱导的DEG主要涉及嘧啶核苷转运蛋白，而厌氧环境则产生包含ATP结合盒结构域蛋白等的DEG，表明细菌通过转录多种基因来适应不同环境，实现降解/耐受污染物的目的。

图2.污染物降解/耐受模式菌株的关键基因组图谱

3、模式菌对污染物降解/耐受的关键基因富集与关键基因途径分析

为了探究模式菌株在不同环境下对TNT及其中间产物降解的GO富集途径差异，作者进行了好氧和厌氧降解机制的GO富集分析。结果显示，好氧环境中蛋白质转运途径显著上调，胞外区途径下调；厌氧环境中新生途径上调，UMP生物合成、细胞质和跨膜转运途径下调。主要差异表达途径为碳水化合物和氨基酸代谢，同时肌醇磷酸代谢和铁载体组非核糖体肽生物合成途径与细菌降解/耐受性相关。七种共表达途径表明细菌通过多种途径适应环境压力。

 图3.模式菌株降解/耐受污染物的关键富集基因途径

进一步地，作者分析了模式菌株在不同环境下肌醇磷酸代谢途径的变化。在有氧环境中，TPI基因在从甘油酮磷酸到甘油醛3-磷酸的途径中显著上调，而厌氧环境中则显著下调。plc基因在从磷脂酰肌醇到肌醇1-磷酸的途径中表达显著降低，同时iolW基因显著上调，iolA基因显著下调。这些变化影响了下游途径如TCA循环和糖酵解/糖异生，提示肌醇磷酸代谢途径可能参与细胞对污染物的耐受机制。此外，模式菌株在降解污染物过程中还调控N/P/S循环，主要调控因子包括亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、半胱氨酸脱硫酶等。

图4.模式菌株降解/耐污染关键基因途径的肌醇磷酸代谢谱分析

4、模式菌降解/耐污染的关键蛋白表达与途径分析

为了探究模式菌株在不同环境下对污染物的降解与耐受机制，作者进行了蛋白质组鉴定和GO、KEGG富集分析。蛋白质组鉴定结果显示，有氧环境中细菌共表达了4082个蛋白质，厌氧环境中则表达了3271个，污染物暴露导致两者间存在显著差异。在好氧环境中，上调的蛋白主要为MBL折叠金属水解酶和糖脱氢酶，而在厌氧环境中，上调的蛋白则主要为含Rhodanese结构域的蛋白和细胞表面蛋白。此外，13种DEP（差异表达蛋白）在好氧/厌氧环境中均在，DEP网络分析揭示了dnaK和guaB为核心蛋白。

图5.模式菌株对污染物降解/耐受相关关键蛋白途径的分析

进一步地，GO和KEGG富集分析揭示了模式菌株在不同环境下对污染物降解的途径差异。好氧环境中，污染物降解主要调控途径为细胞质和胞外区，厌氧环境中则为细胞质和金属离子结合。KEGG富集途径表明，细菌主要调节碳水化合物和氨基酸代谢途径相关的蛋白质表达。丙酮酸代谢途径在好氧和厌氧环境中均受到显著影响，且该途径还与其他如糖酵解/糖异生、柠檬酸循环等途径相互关联，共同参与了细菌对污染物的降解与耐受过程。

图6.模式菌株降解/耐受污染物的关键蛋白质途径的丙酮酸代谢谱分析

5、模式菌降解/耐污染关键代谢产物的表达分析

为了探究模式菌株在不同环境下污染物降解产物的代谢水平差异，作者进行了代谢物学检测与分析。结果显示，有氧环境中检测到139种DEM，其中102种上升；厌氧环境中检测到299种DEM，其中201种上升。核心代谢物主要涉及脂类、有机酸和有机杂环类化合物。细菌通过调节核苷酸、碳水化合物和氨基酸代谢来降解/耐受污染物。关键代谢途径为氨基酸、碳水化合物及辅因子和维生素代谢，柠檬酸循环是代谢网络的核心。共表达富集途径主要涉及核黄素和丁酸代谢，通过显著相关代谢途径的差异表达来调节。

图7.模式菌株降解/耐受污染物的关键代谢途径分析

6、模式菌硝基甲苯降解特性与氧化磷酸化耐受途径分析

为了探究模式菌株在好氧/厌氧环境下硝基甲苯的降解途径，作者分析了菌株的基因组及关键降解途径。结果显示，菌株基因组富含硝基还原酶基因，能高效还原硝基甲苯（TNT）为2-羟基氨基-4,6-二硝基甲苯和2-氨基-4,6-二硝基甲苯，并进一步还原为2,4,6-三氨基甲苯。这些降解产物随后进入甲苯及缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解途径，最终参与基本细胞代谢。这表明模式菌株具有高效的硝基甲苯降解能力。

图8.硝基甲苯降解谱是模式菌株的关键降解途径

此外，作者还进行了氧化磷酸化图谱分析，以探究模型菌株在污染物压力下的耐受途径。实验发现，细菌通过调节细胞色素c氧化酶和ATP合酶的转录表达，以及细胞色素bc1复合物和NADH脱氢酶的翻译水平，显著增强了ATP的合成。同时，代谢产物FMN、NAD+和琥珀酸显著上调，进一步表明细菌通过优化基础能量代谢，特别是氧化磷酸化途径，来增强对污染物胁迫的耐受性。 

 图9.模型菌株关键耐受性途径的氧化磷酸化特征

7、模式菌抗逆基本循环途径与DEG、DEP、DEM相关性分析

为了探究模式菌株在污染物胁迫下的抗逆机制，作者进行了全面的代谢途径分析。结果显示，葡萄糖、脂质和氨基酸代谢中的多个基本循环途径显著表达，如磷酸戊糖途径、丙酮酸代谢、糖酵解/糖生成途径、脂肪酸降解和生物合成途径，以及缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解等。这些途径的物质循环和能量转换在TCA循环中完成，表明细菌通过调节基本循环网络来增强对污染物的耐受/降解能力。

此外，作者还进行了差异表达基因、差异表达蛋白和差异表达代谢产物之间的相关性分析。加权网络分析结果显示，在有氧环境中，核心基因、蛋白质和代谢产物分别是PRD结构域蛋白和N-乙酰基转移酶、5,6-DHET；在厌氧中则是NO诱导的黄素血红素蛋白基因、脱氧核糖磷酸醛缩酶蛋白和As-605240代谢产物。

图10.模式菌株抗逆的基本循环途径

8、模式菌在实际养殖污染水体中的应用

为了探究细菌剂在实际厌氧污染水体中对TNT（硝基甲苯）、2-ADNT和4-ADNT污染物的降解效果，作者进行了实地实验。结果显示，在细菌剂添加48小时后，好氧和厌氧环境中上述污染物均被完全降解。同时，系统中亚硝酸盐、硝酸盐和铵的水平分别显著增加，而pH值则未发生显著变化。这些结果表明，细菌剂在实际应用中能有效降解污染物，并影响水体中的氮循环，但对水体酸碱度影响较小。

作者首次筛选并分离出能在厌氧和好氧环境中高效降解TNT及其典型中间产物（2-ADNT和4-ADNT）的微生物菌株。细菌细胞膜在TNT暴露下受损，但N和Na成为关键调控元件。利用多组学联合分析技术，发现细菌具有丰富的代谢和环境信息处理基因，显著表达与膜转运、细胞骨架维持和信号转导相关的基因。细菌通过调节氨基酸、碳水化合物代谢及N/P/S循环维持能量稳态，关键降解途径为硝基甲苯降解。

原文链接

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34883416/