核桃（Juglans regiaL.）属于产油树种，其果仁富含脂肪酸、蛋白质、维生素和矿物质，具有重要的经济价值。核桃炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）降低核桃产量和品质，严重威胁着核桃产业的健康发展。
2024年5月28日，山东农业大学林学院杨克强、房鸿成课题组在植物学权威期刊《Horticulture Research》上发表了题为“JrPHL8-JrWRKY4-JrSTH2L module regulates resistance to Colletotrichum gloeosporioides in walnut”的研究论文，该研究阐明了JrPHL8-JrWRKY4-JrSTH2L调控核桃对炭疽病抗性的新机制，拓展和深化了我们对WRKY转录因子介导的核桃炭疽病抗性分子机制的认识，为核桃抗病分子育种提供了新思路。
欧易生物对该项目的酵母文库构建及筛选提供技术支持。
发表期刊：Horticulture Research
影响因子：7.6
发表日期：2024年5月
1. JrWRKY4是位于细胞核的转录激活因子
通过在烟草叶片中瞬时表达融合了GFP标签(绿色荧光蛋白)的转录因子—JrWRKY4来进行亚细胞定位分析，发现JrWRKY4-GFP在细胞核中显著富集（图1A）；将重组载体JrWRKY4-pGBKT7和空载体pGBKT7（阴性对照）分别转化到Y2H Gold酵母菌株中进行压力筛选检测，只有转化了重组载体JrWRKY4-pGBKT7的酵母菌在SD/-Trp-His-Ade平板上正常生长，结果表明JrWRKY4具有转录激活活性（图1B）。说明JrWRKY4是一种位于细胞核中的转录激活因子。
图1 JrWRKY4 的亚细胞定位和转录激活活性检测
2. JrWRKY4正调控核桃对炭疽病的抗性
首先，作者将重组载体JrWRKY4-pRI101转染至核桃“B37”叶片中，获得瞬时过表达JrWRKY4的核桃叶片（35S：：JrWRKY4）（图2A），通过qRT-PCR筛选验证，在转染成功的核桃叶片中JrWRKY4基因表达显著增加（图2B）；在接种炭疽病菌后，发现与对照组相比，35S：：JrWRKY4核桃叶片病害症状减轻，病灶面积较小（图2A和C）。
同时，通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术获得了干扰JrWRKY4表达的核桃植株（TRV：：JrWRKY4）。与对照组相比，JrWRKY4在TRV：：JrWRKY4核桃叶中的表达量显著降低（图2E）；接种炭疽病菌后，与对照相比，TRV：：JrWRKY4转基因核桃叶片的病害症状增加，病灶面积更大（图2D和F）。以上结果表明，JrWRKY4正向调控核桃对炭疽病的抗性。
图2 JrWRKY4正调控核桃对炭疽病的抗性
3. JrVQ4通过与JrWRKY4的相互作用来抑制JrSTH2L的转录激活作用
首先，作者通过PlantCARE数据库预测分析，发现只有JrPR5和JrSTH2L启动子含有W-box基序，即WRKY转录因子的结合元件（图 3A）；然后，Y1H互作分析和EMSA验证结果表明JrWRKY4与JrSTH2L启动子中的W-box元件（TTGACC）结合来调控其表达（图3B-D）。之后作者进一步研究了JrWRKY4对JrSTH2L转录活性的影响，发现JrSTH2L在35S：：JrWRKY4核桃中的表达量显著增加，而在TRV：：JrWRKY4核桃中的表达量相应降低（图3eE和F）。接下来在烟草（N. benthamiana）叶片中进行了双荧光素酶测定及活性检测表明，35S：：JrWRKY4与proJrSTH2L：：LUC共表达的发光强度是proJrSTH2L：：LUC个体表达的6倍（图3G和H）。这些结果表明，JrWRKY4可以直接与JrSTH2L启动子的W-box结合，并增强其转录活性。
图3 JrWRKY4与JrSTH2L的启动子结合并促进其转录
为了更深入地了解JrWRKY4参与核桃对炭疽病菌的抗性，以 JrWRKY4蛋白为诱饵，进行了酵母双杂交（Y2H）筛选试验，发现JrVQ4（LOC109013141）可能是与JrWRKY4 相互作用的潜在蛋白。后续作者进行了Y2H、体外下拉实验(Pull-down)和生物分子荧光互补（BiFC）测定，Y2H测定结果表明，JrWRKY4和JrVQ4相互作用（图4A和B）；pull-down试验和BiFC 测定结果证实JrWRKY4直接与JrVQ4互作（图 4C和D）。
图4 JrWRKY4和JrVQ4之间的相互作用
基于前人的研究结果——WRKY-VQ复合物协同或拮抗调节植物生长和抗逆性，作者研究了JrVQ4是否影响JrWRKY4对JrSTH2L的激活。将JrVQ4的CDS插入到 pGreenII 62-SK 载体中，如图3G和H所示，LUC测定结果表明，当35S：：JrWRKY4、35S：：JrVQ4和proJrSTH2L：：LUC共转染烟草叶片时，35S：：JrWRKY4对pro JrSTH2L：：LUC的激活活性几乎完全抑制（图3G和H）。表明JrVQ4 通过与 JrWRKY4 相互作用来抑制 JrWRKY4对JrSTH2L的转录激活。
4.JrPHL8与JrWRKY4启动子结合并增强其转录
为进一步探究JrWRKY4的上游调控因子，作者用JrWRKY4启动子构建重组载体作为诱饵进行酵母单杂交（Y1H）筛选试验，发现MYB转录因子JrPHL8（XM_018951889.2）能够与WRKY4启动子结合。RT-qPCR技术检测分析表明炭疽病菌可以直接诱导JrPHL8的表达(图5A)。为了确认JrPHL8与JrWRKY4启动子之间的结合关系，作者将JrPHL8的CDS序列和JrWRKY4的启动子片段分别克隆到pGADT7和pHIS2载体中，进行Y1H测定分析，结果表明JrPHL8能够与JrWRKY4启动子相互作用(图5B)。
图5 PagARGOS参与了木质素含量的调节
接下来，作者通过PlantCARE数据库分析JrWRKY4启动子区的顺式作用元件，发现了一个推定的MYB结合元件（MBS），用重组JrPHL8-HIS和MBS探针进行EMSA测定分析，结果表明，JrPHL8直接与JrWRKY4启动子的MBS元件（CAACAG）结合（图5C）；此外，双荧光素酶法验证结果表明，与阴性对照相比，35S：：JrPHL8与proJrWRKY4：：LUC共表达的发光强度显著高于阴性对照和proJrWRKY4：：LUC的个体表达（图5D）。这些结果确定，JrPHL8可以直接与JrWRKY4启动子上的MBS结合，并显著增强JrWRKY4的转录。
这项研究阐明了一种新的机制，JrPHL8-JrWRKY4-JrSTH2L通路调节核桃对抗炭疽病菌感染的作用。在炭疽病菌侵染过程中，JrWRKY4通过与JrSTH2L启动子上的W-box结合来增强其转录，从而正向调控核桃对炭疽病菌的抗性；JrWRKY4与JrVQ4之间的相互作用抑制了JrWRKY4对JrSTH2L的转录激活；在炭疽病菌感染过程中，JrPHL8通过与JrWRKY4启动子上的MBS元件结合并增强其转录活性，从而正向调控核桃对炭疽病菌的抗性（图6）。这种抗病机制进一步增强了我们对WRKY TFs介导的核桃抗炭疽病调控网络的理解。
图6 JrPHL8-JrWRKY4-JrSTH2L在核桃对炭疽病菌反应中的作用模型
山东农业大学林学院杨克强教授和房鸿成副教授为本文通讯作者，山东农业大学园艺学院陈学森教授、王楠教授和张宗营副教授对该研究给予了极大的指导和支持。该研究得到了国家自然科学基金，山东省自然科学基金，山东省农业良种工程等项目的资助。