表皮毛(Trichomes )是植物表皮的特殊结构，能够帮助植物抵抗食草动物侵害及环境刺激。蚜虫是黄瓜栽培的主要害虫之一，大量报道认为表皮毛的形成具有一定的抗蚜能力，然而目前还没有证据表明控制表皮毛发育的基因直接参与抗蚜。

近日，中国农业大学刘兴旺/任华中研究团队在期刊《Journal of Advanced Research》上发表了论文“The CsTM alters multicellular trichome morphology and enhances resistance against aphid by interacting with CsTIP1;1 in cucumber”，运用酵母杂交技术揭示了CsTM相互作用并磷酸化CsTIP1;1，对黄瓜表皮毛形态进行调节并赋予黄瓜对蚜虫的抗性。

发表期刊：Journal of Advanced Research

影响因子：11.4

发表日期：2024年4月

研究结果

研究人员在栽培过程中对自发突变体tm及野生型WT茎尖组织上的蚜虫数量进行量化并使用两品系同一生育时期的相同节数和大小的叶片进行蚜虫行为观察，结果表明tm及WT芽尖组织及叶片上的蚜虫数量具有显著差异，tm对蚜虫更为敏感（图1a）。为了解tm对蚜虫敏感度增加的原因，作者使用光学显微镜和扫描电子显微镜对tm和WT的各类组织（叶、茎、卷须、果实、花瓣和根）进行了全面观察，结果显示，tm及WT各组织上存在多种表皮毛类型，而tm的表皮毛基部形态与WT显著不同（图1b）。

图1 tm和WT的蚜虫敏感性统计及各组织形态学观察

在确定tm 表型后，作者通过分析分离群体研究了其遗传性，结果表明tm是一个单隐性基因座。为了明确tm的物理位置，利用多个杂交群体进行了BSA-Seq和KASP 检测，筛选得到与tm基因座相关联的SNP，并最终将tm 基因座缩小到 6.4 kb 的区域，其中只包含一个注释基因 Csa1G056960且SNP位于其第一个内含子中，因此，作者将 Csa1G056960 作为 CsTM 的候选基因。据预测，CsTM 编码一种凝集素类受体激酶，对黄瓜、甜瓜和其他近缘物种的同源 CsTM 蛋白的氨基酸序列进行比对，结果显示所有蛋白都有一个保守的激酶结构域，表明其功能相似。

为了阐明CsTM的功能，作者利用CRISPR/Cas9构建了敲除突变体（图2A），观察结果显示，CsTM的敲除会导致表皮毛整体发育受到影响，表皮毛数量减少且形态产生变化（图2B1-C4），该结果支持CsTM参与表皮毛的形成和形态发育。通过亚细胞定位作者发现CsTM在质膜上的精确定位，而发现Cstm蛋白既定位于细胞核，也定位于质膜（图2D），进一步表达携带不同标签的CsTM和Cstm并对总蛋白及膜蛋白含量进行测定，可观察到膜蛋白中tm丰度的降低（图2E），作者由此推测CsTM对表皮毛的形态的调节作用，与质膜中蛋白质的丰度有关。

图2 CsTM调节膜蛋白丰度改变毛状体形态

为了研究CsTM在表皮毛形态分化中的作用机制，作者首先进行了酵母文库筛选，以CsTM为诱饵共鉴定出11个蛋白，随后，通过酵母双杂验证了这些潜在互作蛋白的真实性，观察到CsALOG (Csa6G519580)、CsCRY (Csa7G397570)和CsCBP (Csa6G522680)不与CsTM发生任何相互作用(图3A)。在剩余互作蛋白中CsTIP1;1(Csa6G448110)是植物水通道蛋白的一员，水通道蛋白在植物生长发育的多个方面发挥着重要作用，作者因此选择CsTIP1;1进行进一步验证。基因结构分析及亚细胞定位结果显示，CsTIP1;1与CsTM具有相似的表达模式，且CsTIP1;1为膜蛋白，这提示两者之间存在潜在的相关性。BiFC和LCI分析证实了CsTM和CsTIP1;1之间的物理相互作用(图3B-C)。体外磷酸化实验表明CsTM具有磷酸化CsTIP1;1的能力(图3E)。综上所述，作者认为CsTM可以在蛋白水平上与CsTIP1;1发生物理相互作用并使其磷酸化。

图3 CsTM与CsTIP1;1相互作用并促使CsTIP1;1磷酸化

H₂O₂是一种稳定的活性氧组分，与生物和非生物胁迫密切相关，研究表明，阻止H₂O₂进入细胞质会损害细胞免疫。为了研究CsTM和CsTIP1;1是否能够对蚜虫的抗性进行调节，作者首先在引入蚜虫后使用细胞质H₂O₂荧光探针H2DCFDA对tm及WT茎尖组织中细胞质H₂O₂进行测定，发现tm的荧光强度明显低于WT，表明WT可能触发更强的免疫应答，这与tm具有更高的蚜虫敏感性相呼应(图4A-B)。作者接着结合病毒诱导的基因沉默和qPCR，下调CsTM和CsTIP1;1的表达水平(图4D)，在引入蚜虫后测定植株上的细胞质H₂O₂含量，结果显示CsTM和CsTIP1;1的表达水平下调会导致植株上表皮毛受损和细胞质H₂O₂含量降低(图4D)，作者以此认为CsTM和CsTIP1;1都可以通过调节黄瓜细胞质H₂O₂含量来增强免疫应答和对蚜虫的抗性。

为了阐明 CsTM 介导的调控途径，作者选择tm和WT开花当天的果实表皮毛进行转录组分析。转录组分析确定了222个DEGs，包括78个上调和144个下调的DEGs（图 5A）。GO分析结果表明，这些 DEGs 主要与发病机制有关，这意味着 CsTM 起着类受体激酶的作用（图 5B）。此外，GO 分析还富集了与 Ca²⁺ 结合和纤维素合成酶相关的 DEGs，作者选择了一些与Ca²⁺ 结合和纤维素合成酶相关的基因进行 qPCR 分析，发现它们在 tm 中的含量都明显下降（图 5C）。进一步通过扫描电镜和能谱（EDS）分析检测 Ca²⁺ 的含量，发现 WT 表皮毛中的 Ca²⁺ 明显高于 tm，除此之外，透射电子显微镜观察结果显示，WT表皮毛细胞壁的厚度较tm更大。

综合以上，作者表示CsTM 作为一种类似受体的激酶，既能调控抗性基因，又能通过化合物合成影响植物发育，这两个过程的整合有助于表皮毛的形态变化和抗蚜虫特性的获得。

图5 WT和tm果实毛状体转录组分析

本研究表明，CsTM负责调控表皮毛的形态发生，其信号肽的缺失会破坏蛋白质的正确定位，从而降低膜蛋白质含量。CsTM与CsTIP1;1在蛋白质水平上能够产生相互作用增强植物对蚜虫的抗性。

中国农业大学任华中教授、刘兴旺副教授为论文共同通讯作者；中国农业大学博士研究生杨松林、薛舒丹等参与了研究工作。该研究受到了国家自然科学基金(资助号:31830080）、国家 “111 ”项目（资助号：B17043）、三亚市崖州湾科技项目、中国农业大学—阿克苏地区农业科技创新专项资金等的支持。