棉花纤维是由发育中的种子外壳的表皮细胞发育而成的单细胞，虽然大家已经了解棉花纤维细胞的发育过程，但是纤维发育早期阶段的时空转录谱和代谢谱还是未知的。本研究结合空间转录组学、单细胞转录组学和空间代谢组学分析了棉花纤维细胞发育早期阶段的转录组和代谢组的动态，鉴定了可能调控纤维细胞早期发育的关键基因(如DOX2、KCS19.4、BEE3和HOS3.7)和代谢物(如亚油酸、精胺、亚精胺和α-亚麻酸)，为进一步研究棉花纤维的发育提供了参考数据集。

2025年1月，由中棉所棉花资源创新与育种课题组马雄风团队及河南大学生命科学学院孙旭武研究团队在国际知名综合性期刊《自然通讯(Nature Communications)》发表的题为 “spatiotemporal transcriptome and metabolome landscapes of cotton fiber during initiation and early development ”(IF：14.7)的研究成果，是国内外首个结合单细胞转录组学、空间转录组学和空间代谢组学揭示棉花纤维发育图谱的文章，确定了一些调控纤维起始发育的关键基因，并通过功能验证发现了BEE3基因在促进胚珠表皮细胞向纤维细胞转化中的重要作用。

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图 研究路线示意图

1、棉花的时空基因表达模式 

为了研究棉纤维早期发育的的时空转录组谱，作者运用空间转录组学技术，对受精前1.5天、受精前1天，受精当天，受精后1天，受精后3天，受精后5天的6个发育阶段的8个样本做了测序分析。根据空间转录组成像结果，将棉纤维早期发育的空间转录表达谱进行聚类分析，可以得到19个基因表达聚类簇，并且每个基因簇都有自己的一套表达模式，在受精前1.5天的切片中TCP5.3(促进生长发育的基因)高表达。受精后3天的切片中，棉花纤维细胞标志性基因高表达，受精后5天，促进跨膜蛋白生成的相关酶基因高表达。

图1 棉纤维发育6个阶段的时空基因表达

2、棉花胚珠中基因表达的单细胞RNA测序分析

为了研究棉花胚珠在受精前1.5天到受精后1天，这4个不同早期阶段的基因表达模式，作者运用单细胞转录组技术从受精前1.5天、受精前1天、受精当天以及受精后1天四个棉花胚珠组织中分析出16个细胞簇，GO富集分析结果显示，脂肪酸生物合成、幼苗发育以及胚胎后发育等功能蛋白在棉纤维发育起始阶段显著富集。

图2 从 -1.5-DPA 到 1-DPA 的棉花胚珠的单细胞转录组分析

接下来，为了分析每个发育阶段起决定作用的基因，作者做了单细胞数据的拟时序分析，并找到了33个在受精当天特异性表达的标记基因，例如：木葡聚糖内转糖基化酶、氨基环丙烷-1-羧酸合酶(ACC)等。GO富集分析发现，与受精前一天相比，受精当天的上调差异蛋白在翻译和核糖体小亚基组装功能上显著富集。此外，还发现很多可能参与调节纤维细胞早期发育的基因。

图3 对受精前1.5天到受精后1天的所有棉花胚珠样品进行拟时序分析

3、棉铃空间代谢物表达谱图分析结果

空间转录组学与单细胞转录组学数据分析表明，一些与激素代谢相关的基因表达，如GH3.6.2、 HOS3.7 和 DOX2等，可能在棉花纤维发育过程中起着关键作用。为了验证激素在棉纤维发育过程中的作用，作者运用空间代谢组学技术对受精前1.5天、受精前1天、受精当天、受精后1天，受精后2天、受精后3天和受精后5天棉花组织的空间代谢物做了研究，代谢结果显示，大多数代谢物表现出高度的空间异质性，比如：脂肪酸、磷脂酸和磷脂酰胆碱在棉花胚珠区域特异性高表达，而磷脂酰肌醇和碳水化合物在腔室区域特异性表达。

4、纤维发育的关键代谢物筛选

通过对空间代谢物的差异分析发现，从受精前1.5天到受精后5天，胚珠中二十碳二烯酸、亚油酸、PE-44:10、精胺、胆碱的表达丰度逐渐降低，表明这些代谢物可能与纤维的起始发育密切相关。相反，胚珠中中α-亚麻酸、组氨酸、油酸和PA(34:1)表达丰度逐渐增加，说明这些代谢物可能与纤维的早期伸长密切相关。

通过对空间代谢组学数据的聚类、表达模式分析以及纤维发育早期的时空解剖学变化结果，发现纤维细胞在受精当天从胚珠外皮细胞开始，然后在受精三天后长度显著增加，表明受精3天是纤维伸长的关键阶段。因此，在受精当天胚珠中高度丰富的差异产生的代谢物(DPM)可能在纤维起始中起关键作用，而在受精三天后胚珠中高度丰富的DPMs可能在纤维伸长中起关键作用。

为了进一步确定纤维起始发育阶段的关键代谢物，作者比较了受精前1.5天与受精当天的空间代谢谱，结果发现受精当天，胚珠中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸盐代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢和组氨酸代谢等通路被激活，亚油酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、α-亚麻酸代谢通路中物质显著下调。

同时将受精后3天与受精前1.5天空间代谢谱作比较，结果发现磷酸戊糖途径，角质、木脂和蜡的生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，淀粉和蔗糖代谢，不饱和脂肪酸的生物合成等通路被激活。精氨酸生物合成，亚油酸代谢，泛酸和 CoA 生物合成，β-丙氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，谷胱甘肽代谢等通路上的代谢物显著下调。

图4 棉花胚珠的代谢物在空间上的异质性

5、转录组和代谢组学数据综合分析

通过将空间转录组数据与空间代谢组学数据的整合分析发现，纤维发育早期LCAT4 或 PLA2-ALPHA催化磷脂酰胆碱代谢为α-亚麻酸，并在胚珠中高度表达。α-亚麻酸不仅可以被 DOX2 催化至 2(R)-HPOT，还可被 LOX3.1.3 至13(S)-HPOT 催化。然后，HPL催化 13(S)-HPOT 代谢为创伤酸。在这个代谢途径中，α-亚麻酸可以通过一系列酶的催化转化为茉莉酸。通过对α-亚麻酸相关基因表达水平的分析，发现这些基因受精后3天和5天细胞核和纤维细胞中高度表达。这些结果与α-亚麻酸在3-DPA和5-DPA胚珠中的高积累一致，进一步说明α-亚麻酸作为标志性代谢物在早期纤维伸长中起重要作用。

通过对α-酮戊二酸、L-天冬氨酸、脂肪酸代谢产物、胺类代谢产物、生长素以及类似油菜素内酯等物质以及相关基因的分析，发现这些物质在棉花纤维早期发育过程中也发挥着重要作用。

图5 α-亚麻酸代谢途径及代谢相关基因综合分析

6、通过原位杂交进行标记基因表达分析

作者利用原位杂交技术验证棉铃早期的空间转录组分析结果的可靠性，结果发现DOX2和SBT4.14在受精前1天的外皮细胞中高表达、 GH3.6.2 在受精当天的外皮细胞中高表达，SWEET15 在受精后3天的外皮细胞中高表达，与空间转录组学结果一致。

图6 RNA 原位杂交揭示的外皮细胞标志基因的时空表达模式

7、GhBEE3 促进棉纤维细胞起始

已有前人报道，油菜素内酯（BRs）能够促进纤维的其实和伸长。在棉花胎盘中，作者检测到编码 BR 信号转导的重要基因GhBEE3 的表达较高，推测可能是GhBEE3通过BR 信号传导影响棉纤维的早期发育过程。为了验证猜想，作者构建了GhBEE3（Gh_A09G062900）过表达和RNAi细胞系，通过扫描电镜观察纤维细胞表面的发育情况，在受精前1天时，ZM24（对照）、GhBEE3-OE 和 GhBEE3-RNAi 植物胚珠上的突出纤维细胞非常少。在 0 DPA 时，GhBEE3-OE 胚珠中突出的纤维细胞数量显著高于ZM24，而 GhBEE3-RNAi 中的突出纤维细胞数量较低。同样，在受精后1天时，GhBEE3-OE 胚珠表面显示的突出纤维细胞明显多于ZM24，而 GhBEE3-RNAi 胚珠表面显示的纤维细胞较少。详细分析显示，在受精后2天和3天时，胚珠表面有相当细长的纤维细胞。此外，GhBEE3-OE 中突出的纤维细胞比ZM24更密集，而 GhBEE3-RNAi 的纤维细胞更稀疏。这些结果表明 GhBEE3 促进棉纤维细胞起始。

图7 GhBEE3 正向调节棉纤维起始

基于合理的多时期采样策略以及空间转录组学、空间代谢组学、单细胞转录组学技术的组合应用，本研究证明了棉花纤维起始和伸长过程中转录组和代谢组的时空图谱。还开发了一个交互式网站，包括本研究中生成的转录组和代谢组，为进一步研究单细胞水平的棉纤维发育提供了参考。同时，本研究也为其他科学家进行类似研究提供了可行的研究策略，并为加速单细胞空间多组学在多种作物物种中的应用提供了关键的方法学模型。