前言
土壤碱化会引发渗透胁迫、离子毒害、高pH损伤及营养缺乏等问题，对植物的危害更甚于中性盐。目前虽然中性盐胁迫耐受机制已有较多研究，但碱性盐胁迫耐受机制仍需深入解析。在我国耕地资源紧张的背景下，葡萄等果树多栽培于盐碱边际土地。盐碱地开发利用已成为国家战略需求，解析葡萄耐盐碱机制对分子育种具有重要意义。
近日，山东农业大学姚玉新研究团队在Plant Biotechnology Journal发表了题为“Ethylene increases the NaHCO3 stress tolerance of grapevines partially via the VvERF1B-VvMYC2-VvPMA10 pathway”的研究论文，通过遗传转化、多组学、酵母单杂交筛选等技术发现乙烯通过VvERF1B-VvMYC2-VvPMA10信号通路调控H⁺和草酸分泌，成功提高葡萄耐碱性。
文库与诱饵
酵母文库：葡萄根组织cDNA文库
诱饵启动子：VvPMA10 (~2kb)
筛选方法：酵母单杂交
验证方法：Y1H assay/EMSA/Dual-luc
研究思路
研究结果
1. 乙烯增强葡萄对NaHCO3耐受性证明
课题组先前的研究发现NaHCO₃可以显著诱导葡萄根中VvACS3（乙烯合成关键基因）的转录和乙烯释放。本研究为进一步明确乙烯在葡萄应答碱胁迫中的作用，设置了对比实验。先用 100 mM NaHCO₃ 模拟碱胁迫，并在 0、14、21 天三个节点比较“单独胁迫”“胁迫＋ACC（促乙烯）”“胁迫＋1-MCP（抑乙烯）”三种处理。结果到第 14 天可看到 ACC 显著减轻叶片萎蔫，21 天时 ACC 组根系活力更高、膜脂过氧化更低，首次证明乙烯能够提升葡萄耐碱性。紧接着，研究者把 VvACS3在葡萄愈伤组织中过表达，让植物自己“多产乙烯”。在正常培养下，转基因与野生型长得一样；但NaHCO₃ 胁迫处理后，发现转基因愈伤组织褐变更轻、生长更快、MDA 更低。并且还发现无论是外施ACC还是过表达VvACS3，都显著升高 PMA活性，同时根际酸化圈变大、草酸释放增多（图1），提示乙烯通过激活质子泵、促进 H⁺和草酸外排来缓解碱胁迫。
图1. NaHCO3胁迫下葡萄根系及愈伤组织中PMA活性、H+及草酸含量变化
2. VvERF1B增强转基因植物的NaHCO₃耐受性和PMA活性
借助转录组数据，研究者锁定了一个被乙烯强烈诱导的转录因子VvERF1B。本研究中进一步构建了VvERF1B 过表达葡萄苗和葡萄愈伤以及 CRISPR 突变的葡萄愈伤。发现在NaHCO₃胁迫条件下，VvERF1B的过表达和突变分别增强了和抑制了转基因葡萄的生长。表现为NaHCO3胁迫处理后，野生型株系叶片表现失绿表型，过表达株系受伤害较轻。且 PMA活性、H⁺ 和草酸分泌与表型同步变化（图2），从而将“乙烯→耐碱”缩小到“乙烯→VvERF1B→耐碱”。
图2. VvERF1B在提高NaHCO3胁迫抗性中的作用
3. 下游靶基因分析：VvERF1B间接调控VvPMA10的表达，从而提高植物耐碱性
为明确VvERF1B 如何上调 PMA，研究者检测了 8 个 PMA 家族基因，发现 VvPMA10表达变化最显著。构建的过表达VvPMA10植物材料也确证其能够增强葡萄耐碱性（图3）。分析VvPMA10启动子，发现其上存在2个ERE顺式作用元件，研究者推测VvERF1B可以靶向VvPMA10 。然而酵母单杂交和 EMSA 结果显示 VvERF1B 并不能直接结合 VvPMA10 启动子，于是研究者推测“中间应还有转录因子”。
图3. VvPMA10在增加葡萄根系和愈伤组织NaHCO3胁迫抗性中的作用
4. 中间因子鉴定：VvMYC2激活VvPMA10表达，增强葡萄愈伤组织对NaHCO₃的耐受性
为阐明VvERF1B诱导VvPMA10表达的分子通路，研究者用VvPMA10启动子做“诱饵”进行酵母单杂交文库筛选，筛选到了bHLH家族成员 VvMYC2。随后通过 Y1H、EMSA 和荧光素酶报告系统证明：VvMYC2 能直接结合 VvPMA10 启动子的 G-box 并激活其表达；而过表达或敲除 VvMYC2 的愈伤在碱胁迫中分别表现出更强或更弱的耐碱性，证实了VvMYC2是VvPMA10的直接上游开关。
图4. VvMYC2转录激活VvPMA10表达及其抗碱功能鉴定
5. VvERF1B与VvMYC2相互作用，促进葡萄愈伤组织中VvPMA10表达上调和耐碱性
既然 VvERF1B 不直接结合VvPMA10 启动子，又需要 VvMYC2 才能启动 VvPMA10，研究者推测两者或许存在互作。通过酵母双杂交、BiFC、Pull-down 和 Split-LUC 四种方法，一致检测到VvERF1B与VvMYC2相互作用（图5），证明VvERF1B 像一名“助推器”，通过与VvMYC2结合来放大后者对 VvPMA10 的转录激活。对此，研究者构建了“双过表达（VvERF1B+VvMYC2）”和“VvERF1B过表达＋VvMYC2 突变”的愈伤，碱胁迫条件下观察到：双过表达材料的耐碱性和通路活性均高于单基因过表达，而VvMYC2 突变则部分削弱了 VvERF1B的促耐受作用(相比野生型虽仍能提高耐碱性)，但VvPMA10表达量确实低于野生型，暗示VvERF1B 可能还通过其他通路独立调控耐盐碱响应（图6）。综上，VvERF1B 通过部分依赖 VvMYC2 介导的途径（如激活VvPMA10）增强 NaHCO₃胁迫耐受性，但同时存在 VvMYC2 非依赖的辅助机制。
图5.VvERF1B与VvMYC2在体外和体内的相互作用
图6. VvERF1B-VvMYC2复合物对VvPMA10表达和NaHCO3抗性的影响
研究总结
乙烯通过VvERF1B-VvMYC2-VvPMA10通路调控NaHCO3胁迫耐受的分子机制
本研究发现乙烯通过激活VvERF1B-VvMYC2-VvPMA10信号通路增强葡萄耐碱能力。VvERF1B受乙烯诱导后与VvMYC2互作，协同激活VvPMA10表达，进而提升质膜H⁺-ATP酶活性，促进H⁺和草酸分泌，最终缓解NaHCO₃胁迫。该研究揭示了乙烯调控葡萄耐碱盐胁迫的分子机制，为作物抗逆育种提供了新靶点。
本项目中所用的葡萄根酵母cDNA文库由欧易生物构建。
山东农业大学园艺科学与工程学院博士生相广庆为该研究的第一作者，山东农业大学园艺科学与工程学院姚玉新教授（https://yyxy.sdau.edu.cn/2024/0227/c1457a232125/page.htm）为该研究工作的通讯作者。研究工作得到了国家自然科学基金等项目的资助。
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14565