腰椎间盘突出（IVDD）是慢性下腰痛的首要元凶，全球致残率居高不下。传统NSAIDs、手术等仅对症处理，无法阻断“衰老-炎症-基质降解”的恶性循环。近年研究发现，衰老髓核（NP）细胞释放的线粒体DNA（mtDNA）与胞外DNA（exDNA）可分别激活cGAS-STING与TLR9-NF-κB两条炎症轴，是驱动IVDD的关键上游事件。然而，如何同时“清除”细胞内外核酸、从源头解决炎症，一直是领域空白，需要更深入地探索。
2025年8月，浙江中医药大学附属杭州市中医院潘浩团队在Nature Communications（IF=15.7）在线发表题为“A multifaceted strategy for intra- and extracellular nucleic acid regulation to alleviate intervertebral disc degeneration”的研究。作者整合单细胞转录组（scRNA-seq）、转录组（bulk RNA-seq）、LC-MS非靶向代谢组三大平台，首次绘制IVDD衰老NP细胞“核酸-代谢-炎症”机制图；并据此开发“可注射自修复H-P智能凝胶”与“线粒体靶向BNPMT纳米囊泡”双模系统，实现胞内mtDNA零泄漏+胞外exDNA一网打尽。
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研究材料
临床样本：6例Pfirrmann I（正常）vs 6例IV级（退变）人NP组织
动物模型：8周SD大鼠针刺IVDD模型
细胞体系：原代大鼠NP细胞、RAW264.7巨噬细胞
组学类型：scRNA-seq（10×Genomics）、bulk RNA-seq（Illumina NovaSeq 6000）、LC-MS非靶向代谢组（Q Exactive HF-X）
研究技术
单细胞转录组：Seurat/Harmony去批次，识别14群4簇衰老NP亚群；
LC-MS非靶向代谢组：OECloud平台（欧易云平台），PCA/OPLS-DA筛选差异代谢物，KEGG通路富集；
RNA-seq+代谢组联合分析：WGCNA共模块+代谢物-基因互作网络，锁定嘌呤/嘧啶-谷胱甘肽-CoA轴；
靶向纳米囊：TPP+NP细胞膜同源靶向，明确线粒体共定位系数>0.9；
自修复H-P凝胶：席夫碱动态键，G′/G″可逆交变，26G针头连续注射无堵塞；
同位素示踪：13C5-谷氨酰胺验证TCA通量恢复。
一、IVDD中的NP细胞衰老：胞质核酸和细胞外DNA引发的炎症激活
首先对公共单细胞数据集GSE165722（n=1人，健康vs退变）进行重新分析并结合自建的6 vs 6临床Bulk RNA-seq队列，发现退变椎间盘14个细胞群中，NP亚群衰老标志最为显著，其中p21、p53、IL-6、CXCL8等基因log₂FC>1且FDR<0.01。GSEA进一步证实SASP、NF-κB、IL-17信号通路显著上调（NES>2.0，FDR<0.05），而氧化磷酸化相关基因集明显下调（NES<-1.5）。整合分析将核酸感应-炎症放大锁定为衰老NP细胞的核心特征，为后续材料设计提供转录组学信息。
图1 多组学锁定衰老NP细胞炎症轴
二、开发线粒体靶向纳米囊泡（BNPMT）以防止NP细胞中mtDNA外泄
接着，进行BNPMT纳米囊构建和靶向验证。采用膜挤出-超声复合工艺制备仿生纳米囊，即先以220nm聚碳酸酯膜连续挤出5次获得NP细胞膜小囊，再于4°C超声（10s on/5s off×10循环）装载BAI1。动态光散射显示平均粒径170±5nm，PDI<0.15；zeta电位由-16.7mV升至-14.5mV，提示TPP成功修饰。HPLC测定BAI1包封率17.8%，载药量2.1%。共定位实验显示，TPP修饰后线粒体Pearson系数由0.31提升至0.71（提升2.3倍），而RAW264.7巨噬细胞摄取量<NP细胞的15%，证实NP细胞同源靶向兼具有线粒体亚细胞定位能力。
图2 BNPMT纳米囊构建与靶向验证
三、BNPMT能有效防止mtDNA外泄，从而缓解衰老神经元细胞的炎症反应
为探究BNPMT是否通过抑制胞质线粒体DNA积累来阻断cGAS-STING通路介导的SASP分泌，首先使用Dox（200nM，24h）诱导建立NP细胞衰老模型，结果表明BAX(6A7)活性表位与TOMM20共定位显著增强，胞浆dsDNA水平显著升高。BNPMT（2.5μM BAI1当量）处理24h后，qPCR显示胞浆dsDNA降低，此外p-STING(Ser366)、p-IRF3(Ser396)、p-TBK1(Ser172)蛋白水平显著下降；IL-6和TNF-αmRNA下调大于50%，ELISA证实其分泌量同步减少。RNA-seq（DESeq2，FDR<0.05）显示NF-κB、IL-17信号通路显著抑制，而COL2A1、ACAN等ECM合成基因表达回升，表明BNPMT通过阻断mtDNA-cGAS-STING轴恢复基质稳态。
图3 BNPMT阻断BAX/BAK介导mtDNA外泄
四、BNPMT诱导衰老NP细胞代谢重编程
进一步通过LC-MS非靶向代谢组鉴定到3247个代谢物，PCA显示NC、SEN、BNPMT三组清晰分离；在VIP>1，p<0.01条件下筛选出156个差异代谢物。关键代谢物变化包括：丙酮酸、L-谷氨酸、还原型谷胱甘肽（GSH）回升；嘌呤/嘧啶中间体（肌苷、尿苷、次黄嘌呤）下降。KEGG富集显示嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢、CoA 生物合成路径显著回调。功能测定证ATP含量增加1.8倍，TMRE线粒体膜电位提升50%，MitoSOX超氧阴离子下降42%，表明能量与抗氧化系统同步修复，这为抗炎抗老化提供代谢保障。
图4 代谢组揭示BNPMT重塑嘌呤/嘧啶-谷胱甘肽-CoA轴
五、H-P凝胶捕获外源DNA的合成与特征
进一步构建了基于氧化透明质酸（OHA）的醛基与第五代聚酰胺胺（PAMAM‑G5）的胺基通过动态席夫碱交联的可注射自愈水凝胶（H‑P凝胶），用于捕获负电外源DNA（exDNA）并抑制椎间盘炎症。该凝胶在室温或生理温度下会快速固化，呈现多孔微结构，利于囊泡装载。流变学表明凝胶具剪切稀化和高弹性，可通过细针注射形成字母“NP”，且在高应变破坏后能在低应变下数秒恢复。PAMAM‑G5表面正电NH₃⁺有效捕获负电CpG‑FITC，流式细胞术证实凝胶显著降低巨噬细胞对CpG的摄取，抑制TLRs激活的M1极化，降低iNOS、IL‑6、TNF‑α等炎症标志物的表达。qPCR/WB/IF一致显示NP细胞COL2↑、ACAN↑，MMP3↓、MMP13↓，ECM稳态重建。表明ECM合成‑降解平衡得到恢复。
图5 H-P凝胶表征与exDNA捕获
六、BNPMT@H-P在穿刺致大鼠椎间盘退变模型中的治疗作用
构建大鼠针刺IVDD模型后，将BNPMT包裹于H-P水凝胶（BNPMT@H-P），实现局部递送并显著延长药物在椎间盘内的滞留时间。ICG 标记的纳米囊泡在H-P水凝胶中可在椎间盘内保留至 21 天，而未包埋的ICG@NPMT仅在第7天即被快速清除。术后4 周，BNPMT@H-P组的DHI与正常对照相当，显著高于单药组；且术后8 周时仍保持较高水平。MRI信号显示，BNPMT@H-P 组的椎间盘含水量恢复明显，信号均匀性优于单药组，组织学检测表明4-8 周观察期内BNPMT@H-P组的髓核组织面积轻度减少，组织丢失量显著降低；纤维化程度较轻。Safranin-O显示蛋白多糖丢失明显减轻。这些实验证实可注射双清零系统持续逆转退变且无明显毒性。
图6 大鼠针刺IVDD模型疗效
七、BNPMT@H-P双模态系统可有效在体内清除胞外DNA
最后，免疫荧光/IHC定量结果表明NP组织dsDNA平均荧光强度显著降低；STING 蛋白表达显著下调；两种关键炎症细胞因子IL-6、IL-1β水平同步下降；衰老标志p16/p21荧光强度明显降低；ECM标志物中COL2上升，MMP3下降。此外，qPCR检测表明髓核细胞胞质中mtDNA含量和exDNA在BNPMT@H-P组显著低于IVDD对照组。结果形成闭环，证实清除致病核酸的同时抑制cGAS-STING与TLR9-NF-κB轴，阻断衰老-炎症-基质降解恶性循环，为IVDD提供疾病治疗新模式。
图7 机制验证
浙江大学团队通过“单细胞转录组+转录组+代谢组”三维度组学，首次阐明IVDD中“胞内外核酸-代谢失衡-炎症衰老”级联机制；据此设计的可注射BNPMT@H-P智能凝胶系统，实现“零泄漏+清环境”双清零，显著逆转大鼠椎间盘退变，为慢性下腰痛提供全新无细胞精准治疗模式。
1. 多维组学交叉：scRNA-seq锁定衰老NP亚群；RNA-seq描绘cGAS-STING/TLR9轴；代谢组揭示嘌呤-谷胱甘肽-CoA轴失衡，形成完整“核酸-代谢-炎症”证据链。
2. 临床转化价值高：凝胶+囊泡均基于FDA认可材料（HA、PAMAM、BAI1），可注射、自修复、21天缓释，具备即刻临床转化潜力。
3. 思路适用场景多：核酸-炎症-衰老轴在骨关节炎、神经退行性疾病、动脉粥样硬化中同样激活，平台策略可复制到多器官退行性疾病。
4. 技术平台成熟：欧易生物为本研究提供LC-MS非靶向代谢组、转录组技术服务，以及生信挖掘的全套服务，助力机制-靶点-材料的闭环研究。
参考文献
Zhao L. et al. A multifaceted strategy for intra- and extracellular nucleic acid regulation to alleviate intervertebral disc degeneration. Nat Commun, 2025. DOI: 10.1038/s41467-025-63194-8