紫斑牡丹（Paeonia rockii）是栽培牡丹的重要品种群，相比普通牡丹，它具有生长势强、抗逆性好（耐寒、耐旱、耐瘠薄）的特点，具有很高的产业应用潜力。其最显著的特征是花瓣基部有一块深色的“色斑”，而花瓣其余大部分区域为“背景色”。此前的研究主要集中在“斑块”颜色的形成机制上，但对于占据花瓣绝大部分面积的“背景色”是如何被调控的，分子机制尚不清楚。

文库与诱饵

酵母文库：‘京红’牡丹花瓣（基部去除）组织cDNA文库

诱饵启动子：1547-bp PrMYB75a promoter

筛选方法：酵母单杂交

验证方法：Y1H assay/EMSA/Dual-LUC

研究选取紫色背景的‘京红’（JH）和白色背景的‘京玉丹’（JYD）两个紫斑牡丹品种，分析花瓣5个发育阶段的表型和色素特征，结果显示：

·表型上，S1-S2阶段两个品种花瓣均为绿色，S3-S5阶段JH逐渐形成紫色背景，JYD始终为白色（图1A）；

·花青素含量上，JH花瓣（去除基部紫斑）S1-S2含量极低，S3显著上升、S4达峰值、S5略有下降，JYD全程无明显花青素积累（图1B）；

·花青素成分上，HPLC-MS检测S4阶段JH花瓣含矢车菊素、芍药素、天竺葵素衍生物，其中芍药素-3,5-二葡萄糖苷（Pn3G5G）为主要成分，JYD未检测到任何花青素（图1C）。

综上确定S3为紫斑牡丹花瓣中花青素合成的起始阶段，花青素是背景色形成的核心物质。

图1.JH和JYD花瓣中色素的定性与定量分析

通过转录组差异分析结合分子验证，筛选出紫斑牡丹花瓣花青素合成的关键MYB转录因子：

转录组DEG分析发现，JH花瓣中11个花青素合成结构基因和3个PrMYB基因显著上调（图2A）；RT-qPCR验证显示，7个早期结构基因在JHS1-S3、4个晚期结构基因在JHS3-S4表达量显著高于JYD（图2B），3个PrMYB中的Pro4G044440在JH S3表达量上调超100倍（图2C）；

系统发育分析显示，Pro4G044440聚类于SG6亚家族（花青素合成经典激活型MYB），与紫山茶中的CsMYB75-like同源，于是将其命名为PrMYB75a；多序列比对证实其为含保守R2/R3重复序列和C1基序的R2R3-MYB蛋白，亚细胞定位验证其定位于细胞核。

图2.JH和JYD花瓣中花青素生物合成相关候选基因的表达分析

通过异源过表达（拟南芥、烟草）和同源VIGS沉默（紫斑牡丹）验证PrMYB75a的功能，结果一致证实其能显著促进花青素合成：

·拟南芥过表达：PrMYB75a-OE株系莲座叶和茎由绿变紫（图3A），花青素含量显著高于野生型（WT）（图3B），花青素合成通路基因均上调；

·烟草过表达：PCR验证获得4个PrMYB75a-OE阳性株系（图3C），花冠由淡粉变红（图3D），花青素含量大幅提升（图3E），PrMYB75a及烟草内源花青素通路基因（NtCHS、NtANS等）表达量显著上调（图3F）；

·紫斑牡丹VIGS沉默：构建PrMYB75a-SL沉默株系，SQ-PCR验证沉默效率（图3G），其花瓣背景色显著褪淡（图3H），花青素含量较空载体（EV）对照组下降80%以上（图3I），PrMYB75a及下游PrCHS1、PrANS等结构基因表达量均显著下调（图3J）。

图3.PrMYB75a在拟南芥、烟草及牡丹JH花瓣中的功能验证

通过启动子顺式元件分析、酵母单杂交、双荧光素酶报告实验、EMSA实验，明确PrMYB75a的直接靶基因及结合位点：

·顺式元件分析显示，PrCHS1、PrF3H、PrDFR、PrANS启动子均含多个MYB结合位点（MBS）；

·酵母单杂交证实PrMYB75a仅能与PrCHS1和PrANS启动子结合，无法结合PrF3H和PrDFR启动子；

·双荧光素酶报告实验显示，PrMYB75a能显著激活PrCHS1和PrANS启动子的荧光素酶活性；

·EMSA实验进一步证实，PrMYB75a可直接结合PrCHS1启动子中靠近ATG的2个MYBCORE基序（Probe-C1、C2），以及PrANS启动子中的1个MYBCORE基序和1个MYB1AT基序（Probe-A1、A2）。

为鉴定PrMYB75a的上游调控因子，研究者构建了1547bp的PrMYB75a启动子，该启动子在两个栽培品种中序列完全相同。于是，研究者以此为诱饵通过酵母单杂交筛选JH牡丹花瓣文库，结果更获得69个unigenes，包含11个转录因子，其中PrFRS2与拟南芥AtFRS2同源，且在JH花瓣中高表达。进一步通过Y1H、EMSA、Dual-LUC验证了PtFRS2确实可以结合PrMYB75a启动子，促进其转录（图4A-C)。为验证PrFRS2在FTP花瓣花青素积累中的生物学功能，研究者进一步构建了VIGS沉默PrFRS2株系，发现沉默株系花瓣背景色明显褪淡，花青素含量下降41%，PrFRS2、PrMYB75a及相关功能基因PrCHS1，PrF3H，PrDFR，PrANS表达量均显著下调（图4D-G）。

图4.PrFRS2通过结合其启动子中的FBS基序激活PrMYB75a

通过烟草过表达结合分子互作实验，发现PrFRS2除调控PrMYB75a外，还可直接靶向PrANS，形成间接+直接的双重调控模式：

·烟草过表达PrFRS2：PCR验证获得4个PrFRS2-OE阳性株系（图5A），花冠红色加深（图5B），花青素含量显著高于WT（图7C），PrFRS2及烟草内源NtCHS、NtANS等通路基因表达量上调（图5D）；

·顺式元件分析显示PrANS启动子含FBS基序，酵母单杂交证实PrFRS2可结合PrANS启动子（图5E）；

·双荧光素酶报告实验显示PrFRS2能显著激活PrANS启动子活性（图5F）；EMSA实验证实PrFRS2直接结合PrANS启动子中的FBS基序（CACGCG）（图5G）。

图5. PrFRS2通过结合PrANS启动子中的FBS基序，直接诱导花青素积累