2021 年 3 月，中国农业大学园艺学院孔瑾教授为通讯作者，在 Plant Physiology 杂志（IF: 6.902）在线发表了题为“MKK4-MPK3-WRKY17-mediated salicylic acid degradation increases susceptibility to Glomerella leaf spot in apple”的研究论文，报道了一个苹果炭疽叶枯病易感相关的转录因子 MdWRKY17，并对其作用机制进行了详细探讨。

中国农业大学单冬茜为第一作者，文章中酵母文库实验由欧易生物完成。

苹果是世界上颇受欢迎的水果。苹果炭疽叶枯病 (Glomerella leaf spot, GLS) 在我国多次爆发，是苹果最具毁灭性的真菌病害之一，严重影响苹果质量和产量。但目前在苹果中尚未鉴定出 GLS 的抗性基因。

MAPK 级联激活是植物防御病原体入侵信号传导过程中的关键事件，MAPKs 靶向并磷酸化调节下游基因转录的转录因子，最终响应病原菌的侵入。WRKYs 转录因子是 MAPK 级联的重要目标，在植物对各种病原体的抗性中起着关键作用。

苹果如何响应炭疽菌入侵，将信号传导到细胞内，以及哪个转录因子负责协调促进 GLS 耐受均尚不清楚。

本研究在苹果炭疽叶枯病易感品种“嘎拉”中发现了一个由苹果炭疽菌感染显著诱导的转录因子 MdWRKY17。

MdWRKY17 过表达植株表现出对炭疽菌的敏感性增加，而 MdWRKY17 RNA 干扰植株表现出相反的表型，表明 MdWRKY17 是炭疽菌感染中的易感因子。MdWRKY17 直接与水杨酸降解基因 MdDMR6 的启动子结合并促进其表达，导致对炭疽菌的抗性降低。此外，MdMPK3 与 MdWRKY17 相互作用并磷酸化 MdWRKY17。同时，MdWRKY17 中多个氨基酸残基在 MdMEK4-MdMPK3 介导下的磷酸化，对于 MdWRKY17 调控 MdDMR6 表达至关重要。

在 6 个易感苹果种质中，MdWRKY17 表达水平显著高于 6 个耐受苹果种质，同时对应的水杨酸含量降低，证实了 MdWRKY17 介导的水杨酸降解在 GLS 耐受中的关键作用。

本研究揭示了转录因子 MdWRKY17 对水杨酸降解和 GLS 敏感性至关重要，为下一步培育抗 GLS 的苹果品种奠定了基础。

1. 炭疽菌诱导转录因子 MdWRKY17 在苹果炭疽叶枯病中起到负调控作用

在炭疽菌易感品种“嘎拉”中，RT-PCR 和免疫印迹检测结果显示，炭疽菌接种后转录因子 MdWRKY17 表达量显著上升（图 A-B）。

与对照相比，过表达 MdWRKY17 植株对炭疽菌更敏感，而 MdWRKY17 RNAi 植株症状明显减轻（图 C-D），表明 MdWRKY17 是苹果炭疽菌抗性的重要负调控因子。
 

图 1：MdWRKY17 负调控苹果中 GLS 耐受性

2. MdWRKY17 被 MdMEK4-MdMPK3 级联磷酸化

磷酸化免疫印迹分析显示，炭疽菌感染后的苹果叶片和愈伤组织中，MdWRKY17 磷酸化水平显著上升（图 A）。

为了筛选磷酸化 MdWRKY17的激酶，进行了酵母双杂交筛选实验，结果显示 MdMPK3 可以与 MdWRKY17 相互作用（图 C），并且通过 BiFC、Co-IP 得以证实（图 D-E）。MdMPK3 的激酶活性水平在炭疽菌感染后也显著上升（图 B）。进一步的 BiFC 和 Co-IP 表明，MdMEK4 可以与 MdMPK3 相互作用（图 F-G）。体外激酶试验表明，MdWRKY17 能够被MdMEK4- MdMPK3 级联磷酸化（图 H）。

综上，MdMEK4-MdMPK3 级联磷酸化 MdWRKY17。

 

图 2：MdMEK4-MdMPK3 级联磷酸化 MdWRKY17

3. MdWRKY17 直接上调 MdDMR6 基因以降解水杨酸

与对照相比，MdWRKY17 过表达植株中水杨酸含量降低，而 RNAi MdWRKY17 植株中水杨酸含量升高（图 A）。

RT-PCR 显示，参与水杨酸生物合成的基因表达水平未有显著改变，但水杨酸降解基因MdDMR6 表达水平在 MdWRKY17 过表达植株中显著上升，在 RNAi MdWRKY17 植株中显著降低（图 B），表明 MdWRKY17 主要介导了水杨酸的降解。

EMSA 和 ChIP-qPCR 实验证实，MdWRKY17 可以直接结合到 MdDMR6 启动子区域的 P2 片段（图 C-D）。体内荧光素报告实验显示 MdWRKY17 可以激活 MdDMR6 的表达（图 E）。体外酶活测定显示，MdDMR6 可以催化水杨酸向 2,5-DHBA 的转化（图 F）。

以上结果表明，MdWRKY17 可以特异性结合到 MdDMR6 启动子以激活其表达。
 

图 3：MdWRKY17 直接上调 MdDMR6 基因以降解水杨酸

4. MdMEK4-MdMPK3-MdWRKY17-MdDMR6 通路降低水杨酸水平并促进 GLS 敏感性

外源水杨酸处理可以逆转 MdWRKY17 过表达植株对炭疽菌的敏感性（图 A-B），表明MdWRKY17 过表达诱导的 GLS 超敏反应可能由水杨酸减少所介导。

在 MdWRKY17 过表达植株中 RNA 干扰沉默 MdDMR6，结果显示水杨酸水平显著升高、叶枯病症状减轻（图 D-F），表明 MdDMR6 介导的水杨酸减少是 MdWRKY17 过表达植株 GLS 超敏性的主要原因。

同样，在 MdWRKY17 过表达植株中 RNA 干扰沉默 MdMPK3，结果显示 MdDM6 表达水平降低、水杨酸含量上升、GLS 耐受增强（图 H-J）。

以上结果表明，MdMPK3-MdWRKY17-MdDMR6 通路在 GLS 耐受中起着关键作用。
 

图 4：MdMEK4-MdMPK3-MdWRKY17-MdDMR6 通路降低水杨酸水平并增强 GLS 敏感性

5. MdMEK4-MdMPK3 介导的 MdWRKY17 磷酸化参与 MdDMR6 表达调控

ChIP-PCR 和荧光素酶报告实验显示，MdWRKY17 过表达显著提高了 MdWRKY17 与MdDMR6 启动子的结合，而沉默 MdMPK3 则会显著降低两者的结合（图 A-B）。

LC-MS、EMSA、体内转录活性实验等表明（图 C-I），MdMEK4-MdMPK3 催化 MdWRKY17 的 S-61、S-66、S-325、S-356 位点发生磷酸化，以增强 MdWRKY17 与MdDMR6 启动子的结合能力，进而激活 MdDMR6 的表达。
 

6. MdWRKY17 调节水杨酸降解对炭疽菌抗性至关重要

进一步检测显示，相比抗性品种，MdWRKY17 mRNA 和蛋白质水平在炭疽菌易感染品种中显著升高（图 A-B）。同时，炭疽菌侵染后，在易感染品种“嘎拉”中 MdDMR6 表达水平显著升高、水杨酸含量显著降低，而在抗性品种“Fuji”中则趋势相反（图 C-D）。
 

图 6：MdWRKY17 调节水杨酸降解对炭疽菌抗性至关重要

本研究确定了 MdMEK4-MdMPK3-MdWRKY17-MdDMR6 这一关键调节途径，它可以在苹果炭疽叶枯病（GLS）敏感品种“嘎拉”中促进水杨酸降解。本研究发现了 GLS 易感性一个以前未知方面的快速调节机制。本研究将有助于苹果品种对炭疽菌抗性的分子育种。

Shan D, Wang C, Zheng X, et al. MKK4-MPK3-WRKY17-mediated salicylic acid degradation increases susceptibility to Glomerella leaf spot in apple. Plant Physiol 2021; doi: 10.1093/plphys/kiab108.