2024年2月，南京中医药大学程海波教授团队在Phytomedicine（IF=7.9）发表题为“Arenobufagin Enhances T-cell Anti-Tumor Immunity in Colorectal Cancer by Modulating HSP90β Accessibility”，该研究利用单细胞转录组测序探索沙地蟾蜍素（Are）的分子靶点并阐明其在结直肠癌中的抗肿瘤机制。
欧易生物助力该项目单细胞转录组测序工作
英文标题：Arenobufagin Enhances T-cell Anti-Tumor Immunity in Colorectal Cancer by Modulating HSP90β Accessibility
发表期刊：Phytomedicine
影响因子：7.9
发表年月：2024年2月
研究材料：小鼠肿瘤组织（n=2）
研究方法：10×Genomics scRNA-seq、scATAC-seq
结直肠癌（CRC）是全球突出的公共卫生问题，其在癌症死亡率中的排名仅次于肺癌和乳腺癌。尽管由于筛查策略和手术技术的加强，早期结直肠癌的生存率有所提高，但晚期结直肠癌患者的治疗结果仍不令人满意，五年生存率不到10%。这迫切需要在开发创新治疗策略方面取得突破。
1. Are治疗小鼠异种移植瘤的单细胞多组学分析
scRNA-seq和scATAC-seq结果进行分析，发现肿瘤组织由癌细胞、巨噬细胞、T细胞、NK细胞、成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞组成（图1B），两组的细胞组成大致一致（图1C）。肿瘤组织中浸润最严重的细胞是肿瘤细胞，分别占对照组和治疗组的84.4%和89.2%，而免疫细胞分别仅占12.4%和10.1%（图1E）。对scATAC-seq和scRNA-seq进行了综合分析，并确定了五个细胞群（图1G）。在scATAC-seq中观察到癌细胞（C05、C03、C02 cells）、T/NK细胞和巨噬细胞的存在，以及这些细胞中高表达的转录因子（图1H）。作者假设肿瘤生长的抑制与这些细胞变化密切相关。
图1 单细胞多组学分析揭示Are抑制肿瘤生长
2. Are抑制肿瘤细胞中CD247的表达
作者对肿瘤细胞突分为七个cluster（图2A-B）。与PBS处理组相比，C02、C06和C07 cluster显著减少（图2C）。这三组肿瘤细胞的GSVA分析显示，许多免疫相关的生物学过程被富集，如免疫反应的负调节、对干扰素-α-羟色胺的细胞反应、先天免疫反应、白细胞介素-4介导的信号通路的正调节、炎症性肠病（IBD）和NOD样受体信号通路（图2D）。这表明Are的抗肿瘤作用可能与肿瘤免疫密切相关。转录因子的分析表明，Stat1、Stat3、Irf1、Irf2、Nfkb1和Nfkb2在这些肿瘤细胞亚群中高表达，所有这些转录因子都与免疫检查点密切相关。Are的抗肿瘤功能可能与免疫密切相关（图2E-F）。CD274的表达在几乎所有肿瘤细胞亚群中均降低（图2G-H）。给药后肿瘤组织中CD274的蛋白水平表达降低（图2I）。
图2 Are靶向抑制肿瘤细胞并下调CD274的表达
伪时序分析结果表明，肿瘤细胞C02和C07逐渐向其他肿瘤亚群分化（图3A）。基因富集也显示了CD274表达的下降趋势，与肿瘤细胞的时间进展一致（图3D）。此外，与肿瘤免疫微环境相关的基因的表达，如CD 39、CD86、PDCD1LG2等基因的表达趋向于改善免疫微环境（图3B和图3E-F）。
图3 伪时序分析，CD274表达减少
3. 细胞间通讯分析显示Are可以改善结肠癌相关的免疫抑制
细胞间通讯分析表明， Are处理后通信强度和数量都有显著增加（图4A-4B）。作者分析了每个肿瘤亚群和T/NK细胞之间的通讯情况，交流的数量和强度都有小幅下降的趋势（图4D）。与对照组相比，除了C02之外，源自受体细胞的通讯强度减弱。当T/NK细胞作为配体细胞时，它们与肿瘤亚群的交流较弱（图4C）。在免疫抑制途径如PD-L1、PD-L2和IL2中有明显的抑制作用（图4E），表明Are可能通过改善免疫抑制状态发挥其抗肿瘤作用。作者进一步说明了对照组中PD-L1途径的表达情况，其中T/NK细胞与每个肿瘤细胞群具有一定的通讯相关性，其中最强的是与C07通讯相关性（图4F）。
图4 Are处理引起细胞间通讯改变
4. 利用TRAP技术发现Are靶蛋白HSP90β
作者采用TRAP技术通过在蛋白质组水平上研究赖氨酸可及性的变化来鉴定Are-结合蛋白（图5A）。在TRAP分析检测到的对Are治疗有可及性改变的蛋白质中，HSP90β蛋白的可及性显著降低了9.62倍（在所有蛋白质中降幅最大），因此将HSP90β指定为相互作用蛋白（图5B）。微量热泳动（MST）分析结果显示Are和HSP90β具有更高的结合亲和力（图5C）。随后通过CETSA方法验证了Are和HSP90β之间的相互作用。结果表明，与对照组相比，即使在高温下，HSP90β的热弹性也显著增强（图5D）。利用Uniprot数据库中HSP90β的蛋白序列，预测了Are和HSP90β之间的结合位点。结果发现Are与HSP90β蛋白的ASN310和ASN352残基形成氢键，并与PRO340和LEU343残基形成疏水相互作用（图5E）。
图5采用TRAP方法鉴定Are的靶蛋白HSP90β
5. Are减弱了p-STAT3和HSP90β之间的相互作用
作者首先探索了HSP90β敲低对STAT3和PD-L1表达水平的影响。HSP90β敲低，PD-L1表达下降， STAT3的mRNA水平几乎没有变化。p-STAT3和STAT3在蛋白质水平上的表达降低（图6A）。对HCT116细胞增加Are处理浓度，荧光显微镜观察到PD-L1荧光降低（图6B）。HSP90β的蛋白水平变化不明显， p-STAT3和stat 3的表达在Are浓度升高时降低（图6C）。尽管Are处理没有直接降低HSP90β的表达，但它削弱了p-STAT3/HSP90β之间的相互作用，p-STAT3/HSP90β是可以进入细胞核激活多个基因（包括PD-L1）转录。
图6 Are在体外减弱HSP90β/STAT3复合物并降低PD-L1表达
6. Are体内抑制肿瘤生长和PD-L1表达
小鼠肿瘤模型腹膜内注射给予Are和BSM-1（PD-1/PD-L复合物抑制剂）。Are和BSM-1均降低了异种移植肿瘤的大小和重量（图7A-7C）。细胞增殖标志物Ki-67和PD-L1的表达在Are、BSM-1处理后和联合治疗后降低（图7D-7E）。
图7 Are体内抑制肿瘤生长，降低Ki-67和PD-L1的表达
7. Are干扰CRC患者来源的类器官并增加T细胞浸润
作者用CRC患者来源的肿瘤在体外培养为类器官（PDOs）。PDO的IC10、IC25和IC50，分别为85、209和514 nM。Are IC10和IC25处理后都降低了PDOs的总面积（图8A-8C）。不同组间的类器官计数没有变化，但与对照组相比，IC10和IC25处理后的类器官面积下降（图8D-8E）。HE显示，在处理后PDOs的细胞核碎裂和破裂，而Ki-67染色减少（图8F）。Are IC10处理12h和24h导致T细胞富集（图8G）。T细胞+Are组表现出最低的细胞活性（图8H）。
图8 CRC PDOs对Are治疗有反应并表现出T细胞富集
本研究揭示了Are在结直肠癌中的抗肿瘤机制。Are可以通过调节免疫检查点，特别是通过抑制PD-L1的表达，在相对较低的浓度下抑制肿瘤生长。这是由于Are对HSP90β的可及性显著降低，随后导致HSP90β-STAT3-PD-L1轴的活性降低。进一步研究发现，对患者来源类器官的分析表明，治疗后淋巴细胞（主要是T细胞）的富集。本研究扩展了对Are抗肿瘤机制的理解，为其治疗用途的潜力提供了新的视角。
参考文献：Shang Z, Fan Y, Xi S, et al. Arenobufagin Enhances T-cell Anti-Tumor Immunity in Colorectal Cancer by Modulating HSP90β Accessibility[J]. Phytomedicine,2024. https://doi.org/10.1016/j.phymed.2024.155497.