苹果树腐烂病(AVC)是由苹果黑腐皮壳菌侵染引起的枝干病害，严重影响苹果的产量和品质，本研究以Vm（Valsa mali）的效应蛋白VmPR1c为研究对象进一步了解其作用机制，为苹果抗病育种提供了重要的基因资源和理论依据，既具有科学意义，又具有潜在的生产应用价值。
近期，西北农林科技大学黄丽丽教授团队在Plant Physiology发表了题为“Valsa mali PR1-like protein modulates an apple valine-glutamine protein to suppress JA signaling-mediated immunity”的论文。该研究揭示了苹果树腐烂病菌关键效应蛋白VmPR1c通过靶向苹果VQ蛋白MdVQ29来干扰寄主免疫应答反应，进而促进Vm侵染的分子机制。
1. 瞬时表达VmPR1c的苹果叶片容易受到腐烂病菌(Vm)的感染，并且VmPR1c靶向影响MdVQ29的表达
前期的研究基础表明VmPR1c是苹果感染Vm导致细胞致死的毒力效应因子，具有N端信号肽(SP)，能够促进酵母菌分泌转化酶，是一种分泌蛋白。本研究中作者对该基因进行深度挖掘分析，首先通过GFP荧光检测分析发现在Vm侵染过程中能够进入苹果细胞核，但缺乏SP时在细胞中无法检测到相应的荧光信号(图1A)，将瞬时表达VmPR1c-GFP的苹果叶片接种Vm，结果发现与对照组相比，表达VmPR1c-GFP的叶片更易受到Vm的感染(图1B、C)，表明VmPR1c是Vm的毒力效应子。
图1 VmPR1c的瞬时表达
接下来作者利用Y2H筛选与VmPR1c互作的候选靶蛋白，对14个候选蛋白进行Vm 接种前后表达量检测，其中MdVQ29的变化最为显著，通过Y2H检测、Co-IP和BiFC互作分析证实VmPR1c与MdVQ29直接互作(图1D-F)；作者分别将VmPR1c和MdVQ29分段来验证影响两者互作的关键残基，结果发现VmPR1c和MdVQ29之间的相互作用依赖于VmPR1c中的CAP结构域和MdVQ29中的VQ结构域。
2. MdVQ29正调控苹果对苹果树腐烂病(AVC)的抵抗力
作者构建了MdVQ29过表达和基因沉默的稳定转基因植株，接种Vm后对转基因植株进行病害评估发现过表达MdVQ29的转基因植株的叶片和枝条的病灶面积和长度最小，WT次之，沉默株系最大(图2A)；测定叶片中H2O2、O2-、胼胝质含量发现在过表达MdVQ29的转基因植株中最高，WT次之，沉默株系最少(图2B-D)，表明MdVQ29过表达增加了苹果对AVC的抗性，而基因沉默降低了抗性。随后，对接种ΔVmPR1c的MdVQ29-OE株系中MdVQ29的蛋白丰度进行检测发现，与接种WT-菌株相比，MdVQ29-HA的蛋白丰度显著增加，表明MdVQ29参与了VmPR1c介导的致病机制。
图2 MdVQ29正调控苹果对苹果树腐烂病(AVC)的抵抗力
3. MdWRKY23 参与MdVQ29调节的免疫反应
作者通过Y2H(IP-MS筛选，Y2H 验证)筛选发现与MdVQ29相互作用的转录因子MdWRKY23，随后，体内Co-IP、BiFC和荧光素酶互补成像（LCI）测定进一步证实了MdWRKY23和MdVQ29之间的相互作用(图3)。
图3 MdWRKY23和MdVQ29之间的相互作用
接下来将MdWRKY23在苹果叶片中瞬时表达发现，MdWRKY23过表达的苹果叶片病变面积最小，WT次之，沉默植株最大(图4A-C)；此外，作者在苹果愈伤组织中过表达MdWRKY23，构建稳定的转基因株系，MdWRKY23的转录水平显著提高，通过病害评估发现随着MdWRKY23表达量的增加，苹果愈伤组织的病变面积显著减少(图4D、E)，这些结果表明MdWRKY23正向调节苹果对 AVC的抗性。
图4 MdWRKY23 正向调节苹果对 AVC 的抗性
4. MdWRKY23通过结合MdCOI1的启动子转录激活其表达来参与苹果对AVC的抵抗力
MdWRKY23作为转录因子，可能通过调节靶基因的表达在免疫反应中发挥作用，作者通过DAP-seq鉴定分析发现18.28%的结合峰分布在启动子区域，结合GO富集分析发现大多数靶基因位于细胞核中(图5A、B)，KEGG分析发现其中植物激素信号转导通路是富集最多基因的通路，基于此作者鉴定了ABA、SA、ETH、MeJA、IAA和BR等各种处理下MdWRKY23的相对表达量，发现MeJA处理对MdWRKY23的相对表达诱导最显著，此外，MeJA处理能够增强苹果叶片对AVC的抗性。随后，作者通过对MdWRKY23过表达苹果愈伤组织中与JA信号通路相关的基因的定量检测发现，MdCOI1的相对表达量最高。接下来作者通过EMSA、Y1H、LUC和GUS活性测定检测技术证实，MdWRKY23直接与MdCOI1启动子结合转录激活其表达(图5C-F)。
图5 MdWRKY23通过转录激活MdCOI1表达来调控JA信号通路
5. VmPR1c能够促进MdVQ29的降解并抑制MdVQ29和MdWRKY23之间的相互作用
之前的研究发现VQ蛋白与转录因子形成复合物以影响它们的转录活性并执行其调控功能，在这里作者通过LUC荧光检测分析发现，与单独表达MdWRKY23相比，共表达MdVQ29和MdWRKY23时荧光信号最强，同时表达VmPR1c、MdVQ29和MdWRKY23时荧光信号减弱，表明MdVQ29能够促进MdWRKY23的转录活性，VmPR1c能够抑制MdVQ29介导的MdWRKY23的转录活性(图6A)；通过瞬时表达试验分析发现与对照组相比，共表达VmPR1c和MdVQ29的叶片病灶面积显著增大，单独表达MdVQ29的叶片病灶面积减小(图6B)，同时检测其蛋白丰度发现与单独表达MdVQ29相比，共表达VmPR1c和MdVQ29的叶片中MdVQ29-GFP的蛋白质丰度明显降低(图6C)；
图6 VmPR1c抑制MdVQ29增强的MdWRKY23的转录激活活性
随后，作者通过Y3H检测分析发现，VmPR1c存在时MdVQ29和MdWRKY23的相互作用强度显著降低(图6D)，同时通过Pull-down检测分析发现VmPR1c存在时MdWRKY23的蛋白丰度显著减弱(图6E)，因此作者推测VmPR1c可能通过促进MdVQ29的降解来抑制其促进转录的能力。随后作者通过试验证明，当VmPR1c-Flag存在时，MdVQ29-GFP的蛋白丰度显著降低，而GFP对照组的蛋白丰度不受VmPR1c-Flag的影响，蛋白酶体抑制剂MG132抑制了MdVQ29-GFP的降解(图6F)，表明VmPR1c能够促进MdVQ29在体内的降解。
上述结果表明，VmPR1c通过促进MdVQ29的降解、抑制MdVQ29的表达和MdVQ29与MdWRKY23之间的相互作用来抑制MdVQ29介导的MdWRKY23的转录激活活性，从而抑制了MdVQ29-MdWRKY23-MdCOI1模块介导的抗性。
研究结论
本研究表明，在正常条件下，MdVQ29通过调节JA信号通路来发挥苹果对AVC的抵抗力，形成VQ蛋白调节AVC的调控网络。当苹果感染Vm时，VmPR1c与MdVQ29的互作能够促进MdVQ29的降解、抑制MdVQ29表达和MdVQ29-MdWRKY23相互作用，从而抑制MdVQ29介导的苹果AVC抵抗力。
图7 VmPR1c和MdVQ29在苹果抵抗AVC中的作用机制
西北农林科技大学植物保护学院黄丽丽教授为该论文的通讯作者，博士研究生韩朋良和王程利为该论文的共同第一作者，这项研究受到了作物抗逆与高效生产全国重点实验室的技术支持，得到了国家自然科学基金项目和国家自然科学基金-新疆联合基金项目的资助。