2024年7月2日，中国科学院深圳先进技术研究院脑认知与脑疾病研究所/深港脑科学创新研究院朱英杰团队在Neuron期刊上发表了题为“Cellular and circuit architecture of the lateral septum for reward processing”的研究论文，深圳先进院朱英杰课题组的博士后陈高伟、云南大学博士生赖诗诗为论文的共同第一作者。

本文详细描述了外侧隔核脑区（LS）的单细胞转录图谱及其主要神经元类型的空间分布，并发现集中在腹侧亚区的雌激素1型受体阳性神经元（LS^Esr1）通过激活腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元促进奖赏效应且在甲基苯丙胺（METH）成瘾中发挥重要作用。

欧易生物助力本研究单细胞核转录组测序服务。

发表期刊：Neuron

影响因子：14.7

涉及的欧易生物服务产品：单细胞核转录组测序

外侧隔核脑区（LS）是边缘大脑的一个区域，先前的研究表明它在动机和情感中扮演关键角色，尤其是在奖赏系统中发挥重要功能。然而，对于LS区域中不同类型的神经元、它们的转录特征、空间分布以及它们如何连接和相互作用，从而影响奖赏和成瘾行为的具体机制，科学界了解甚少。

随着单细胞核RNA测序（snRNA-seq）和光遗传学等先进技术的发展，研究者现在能够更精确地识别和操纵特定的神经元群体。这项研究强调了对LS区域细胞异质性的深入了解，以及这些细胞类型如何参与调节奖赏和成瘾行为的重要性。通过识别和操纵特定的神经元群体，研究旨在揭示大脑如何加工奖赏信息，并为开发治疗成瘾的新策略提供潜在的靶点。

LS由多种异质性细胞类型组成，对各种动机行为至关重要。然而，这些细胞类型的转录谱、空间排列、功能和连接性尚未得到系统研究。利用单细胞核RNA测序技术，作者描绘了LS中多种遗传定义的细胞类型，它们在奖赏处理中扮演不同的角色。作者发现表达雌激素受体1（Esr1）的腹侧LS（LS^Esr1）神经元是奖赏寻求的关键驱动因素，通过向腹侧被盖区（VTA）的投射，这些神经元在甲基苯丙胺（METH）奖赏和METH寻求行为中发挥了重要作用。长期暴露于METH通过上调超极化激活的环核苷酸门控（HCN）通道，增加了LS^Esr1神经元的兴奋性，从而促进了METH诱导的运动敏化。

1. snRNA-seq揭示间隔区的主要细胞类型

作者在成年雄性小鼠的活体大脑切片中微解剖了包括LS和内侧隔核（MS）的间隔区，将组织进行snRNA-seq（图1A），聚类分析得到15个不同的神经元簇（图1B和1C），并鉴定出了每个簇的标记基因（图1D）。在大多数神经元簇中表达GABA合成基因谷氨酸脱羧酶1（Gad1），囊泡谷氨酸转运体2（Vglut2）阳性的谷氨酸能神经元主要在14和15簇中发现，胆碱乙酰转移酶（Chat）和促肾上腺皮质激素释放激素受体 2（CRHR2）在8簇中富集（图1E和1F）。作者还鉴定出了LS中的一些新的神经元群体（见图1G）。

图1 snRNA-seq揭示间隔区的主要神经元类型

2. 在间隔区中主要神经元类型的空间组织

作者使用了原位测序（ISS）方法发现囊泡GABA转运体（Vgat）阳性的GABA能神经元遍布间隔区，而Vglut2阳性的谷氨酸能神经元主要分布在腹内侧LS和MS区域（图2B）。接下来，作者使用ClusterMap分析生成了7个在转录和空间上定义的细胞簇（图2C-2E）。作者选择了以Sst、Nts或Esr1为标记三个簇（图2F和2G）,通过RNAscope原位杂交确认了表达这些标记基因的神经元的空间模式（图2H）。Sst阳性、Nts阳性和Esr1阳性的LS神经元（LS^Sst、LS^Nts和LS^Esr1）分别分布在LSd、LSi和LSv（图2H和2I）。

图2 间隔区主要神经元类型的空间组织

3. LS^Esr1神经元在奖赏处理中被激活并促进了正向强化

作者在小鼠中注射了Cre依赖的基因编码的Ca²⁺指示剂（GCaMP6s）的腺相关病毒（AAV），并植入了光学纤维到LS以记录LS^Esr1、LS^Nts和LS^Sst神经元的活动（图3A-3C），以此来检查每种LS神经元亚型在寻求奖励（巧克力奖励，社交互动和静脉注射METH）中的活动。结果表明只有LS^Esr1神经元被各种奖赏类型一致性地激活。作者在小鼠中注射了携带光敏蛋白ChR2的AAV，它可以选择性地在LS^Sst、LS^Nts和LS^Esr1神经元中表达ChR2（图3P和3Q）。通过自我刺激测试（图3R-3T)，和实时位置偏好（RTPP）测试（图3R和3U-3V)，作者判定是光遗传激活LS^Esr1神经元促进了正向强化。

图3 LS神经元亚型的不同奖赏处理

4. LS^Esr1神经元通过VTA中多巴胺能神经元的去抑制促进正向强化

顺行示踪实验发现，LS^Esr1神经元投射到VTA脑区，而LS^Sst或LS^Nts神经元不投射到VTA（图4A和4B）。接着，作者用光遗传学测试了从LS^Esr1神经元到VTA的投射的激活具有正强化效应（图4C和4D），发现LSEsr1→VTA通路的光激活支持自我刺激并诱导位置偏好（图4E和4F）。随后，发现LS^Esr1轴突末梢的光刺激在VTA的GABA能神经元中诱发了强烈的抑制性突触后电流（IPSC）（7/8）（图4H和4I）。基于此，作者假设LS^Esr1神经元的激活将抑制VTA GABA能神经元，然后通过去抑制机制激活多巴胺能神经元。随后作者通过光遗传学激活（图4J-4L）和荧光多巴胺探针（图4M-4P）验证了这一猜想。

图4 LS^ESR1神经元通过投射到VTA和去抑制多巴胺能神经元促进正强化

5. METH而非可口食物或社交互动在LS中诱导多巴胺升高

通过逆行示踪实验，作者在LS中检测到许多起始细胞（图5A）,发现LS^Esr1神经元从VTA多巴胺能神经元接收直接突触输入（图5B-5D）。通过VISOR 3D重构单细胞水平神经投射，清楚地看到一些VTA多巴胺能神经元将长距离轴突发送到间隔区，导致密集的神经支配（图5E和5F）。随后，作者在LS^Esr1神经元中表达了多巴胺探针GRAB_DA2h（图5G），发现只有腹腔注射METH会诱导立即和持久的多巴胺升高（图5H-5J）。

图5 METH诱导LS多巴胺释放

6. LS^Esr1神经元对METH奖赏和METH寻求行为是必需的

为了研究LS^Esr1神经元对奖赏寻求行为的贡献，作者通过表达破伤风毒素轻链(TeNT)选择性地阻断了LS^Esr1的突触输出（图6A和6B）。结果表明LS^Esr1神经元对食物和社会奖赏都不是必需的（图6C-6I）。然而，在静脉METH自我给药实验中，用TeNT沉默LS^Esr1神经元显著抑制了METH寻求行为（图6C和6J-6I）。此外，TeNT表达几乎完全消除了METH诱导的条件性位置偏好(CPP)（图6M）以及METH诱导的过度运动（图6N）。为了检验LS^Esr1神经元是否在线索诱导的METH复吸行为中发挥作用，作者向Esr1-Cre小鼠的LS中注射了AAV-DIO-hM4Di，以实现化学遗传抑制，这允许作者在线索呈现之前特异性抑制LS^Esr1神经元（图6O和6P）。结果表明LS^Esr1神经元也是线索诱导的METH复吸行为所必需的（图6Q）。

图6 LS^Esr1神经元是METH奖励和METH寻求行为所必需的

7. LS^Esr1神经元中HCN的表达升高介导METH导致的行为敏化

作者使用膜片钳电生理技术发现METH处理显著增加了LS^Esr1神经元的自发动作电位发放频率（图7A）并且兴奋性显著增强（图7B），HCN电流增加（图7C和7D）。snRNA-seq数据分析显示，在LS^Esr1神经元群体中Hcn1特异性显著富集（图7E）。通过使用选择性HCN阻断剂（图7E）和小鼠实验（图7G），表明METH处理后LS^Esr1神经元中Hcn1上调。作者发现shRNA介导的Hcn1敲除实验进行了进一步的验证（图7J-7L）。总的来说，这些结果表明METH诱导的LS^Esr1神经元中的可塑性变化可能是METH成瘾的重要驱动因素。

图7 HCN电流（Ih）介导的LS^Esr1过度兴奋性有助于METH诱导的运动敏化

本文的研究结论强调了LS中特定神经元群体在奖赏处理和METH成瘾中的核心作用。通过单细胞核RNA测序技术，研究揭示了LS^Esr1在奖赏寻求行为中的关键性。研究进一步发现，METH的长期暴露能够通过上调HCN1通道增强LS^Esr1神经元的兴奋性，导致运动敏化现象。

此外，LS^Esr1神经元的激活与METH诱导的过度运动、条件性位置偏好、自我给药和线索诱导的复吸行为紧密相关。重要的是，HCN1通道的敲除能够阻止METH诱导的运动敏化，表明这一通道在成瘾行为中扮演了关键角色。这些发现不仅为理解奖赏和成瘾的神经机制提供了新的视角，而且为开发针对METH成瘾的潜在治疗策略提供了新的靶点。