棉花纤维是植物细胞中最长的细胞之一，其生长过程复杂且精细，纤维的细胞发育直接关系到棉花的产量和品质。因此，深入理解调控棉花纤维发育的分子机制对于棉花的遗传改良具有重要意义。
近日，武汉大学朱玉贤院士研究团队在Plant Communications上发表了题为“GhATL68b regulates cotton fiber cell development by ubiquitinating the enzyme required for b-oxidation of polyunsaturated fatty acids“ 的研究论文，该研究应用酵母杂交等技术发现纤维特异E3泛素连接酶GhATL6b通过调节多不饱和脂肪酸（PUFAs）代谢中限速酶的稳态影响棉纤维细胞发育。
酵母文库：棉花酵母cDNA文库
诱饵蛋白：GhATL68b-A
筛选方法：酵母双杂交（GAL4系统）
验证方法：分裂荧光素酶互补试验/Pull-down
技术路线
1. 棉花GhATL68b启动子的结构变异与甲基化缺失有关
为了研究不同棉种间棉花纤维细胞存在明显长度差异的原因，研究者通过WGBS、RNA-seq等测序分析，发现了一个E3泛素连接酶基因GhATL68b，在四倍体陆地棉（G. hirsutum）和二倍体草棉（G. herbaceum）、亚洲棉（G. arboreum）、雷蒙德氏棉（G. raimondii）启动子区有明显的结构变异（SVs）和甲基化修饰差异，并且该基因在棉纤维中特异性表达，推测GhATL68b在棉纤维发育过程中可能发挥作用（图1A）。
图1 不同棉花ATL68b启动子区SVs分析及DNA甲基化模式特征
2. GhATL68b在不同种棉花中的进化分析
通过系统的比较基因组学和系统发育分析，研究者发现ATL68b在植物界中高度保守，其功能位点很容易追溯到莱茵衣藻和小立碗藓，并且早在古生菌中就出现了。在一些物种中ATL68b以单拷贝形式存在，在拟南芥中存在2个同源基因ATL67和ATL68。并且在物种进化过程中，可能存在重复事件发生，因为在所有二倍体棉种中发现了4个拷贝，而在异源四倍体棉花基因组中发现了8个拷贝。
3. GhATL68b可以调节棉纤维的发育
为了确定GhATL68b在陆地棉中的生物学功能，研究者通过CRISPR-Cas9构建了GhATL68b功能缺失突变体株系，突变体株系在营养生长阶段均表现正常（图2B），但纤维平均长度从29 mm降低至24 mm（图2C），纤维断裂伸长率、纤维均匀性和100粒种子的总纤维重量在突变体株系中都显著降低（图2F）。
图2 GhATL68b影响棉纤维发育
4.GhATL68b与GhDECR互作并介导其泛素化降解
由于GhATL68b-A是一种E3连接酶，研究者通过酵母双杂交筛选试验来探索其潜在的泛素化靶点，其中过氧化物酶体2,4-二烯基-辅酶A还原酶被多次筛选到，被认为是潜在互作蛋白。通过Split-LUC以及pull down进行了体内外互作验证证实（图3A-C）。并通过体外泛素化和蛋白降解实验，证明了GhATL68b可以通过26S蛋白酶体途径介导GhDECR的降解（图3E-I）。对体内蛋白含量检测也发现，ghatl68b突变株中GhDECR蛋白积累量显著高于野生型（图3J）。
图3 GhATL68b与GhDECR相互作用并泛素化GhDECR
5. GhDECR的积累降低了PUFAs的含量
与野生型相比，ghatl68b突变体中GhDECR发生积累，导致酶活增强，辅酶反应速率提高，加速了多不饱和脂肪酸（PUFAs）的氧化代谢过程。突变体纤维细胞PUFAs含量降低，导致细胞膜流动性下降，从而影响纤维细胞发育（图4）。
图4 GhDECR积累降低了纤维细胞PUFAs含量及细胞膜流动性
6. 外施PUFAs可以恢复ghatl68b突变体纤维变短的表型
研究者发现，通过向胚珠培养基中添加外源PUFAs可以弥补突变体纤维缺陷生长表型。分析发现C18:0等饱和脂肪酸主要参与磷脂R1链的形成，C18:1、C18:2和C18:3等不饱和脂肪酸则主要参与R2链的形成。R2链中的不饱和键保证了细胞膜流动性，不饱和键越多形成的 R2链可能越柔软。因此，该研究结果为PUFAs通过影响膜流动性而提高纤维生长速率提供了一个可能的理论模型（图5）。
图5 外源施加PUFAs可以恢复突变体纤维生长缺陷表型
本研究发现GhATL68b与GhDECR相互作用并使其泛素化降解，进而调控多不饱和脂肪酸（PUFAs）的代谢，影响细胞膜的流动性，最终影响了纤维细胞的伸长。这项研究不仅丰富了我们对棉花纤维发育分子机制的认识，也为通过遗传工程手段改良棉花纤维品质提供了新的策略。
武汉大学博士研究生李鑫为论文第一作者，朱玉贤教授为论文通讯作者，王坤教授、周一凡博士参与了本项目的研究，中国科学院遗传发育与生物学研究所黄盖副研究员也部分参与本项目。该研究得到了国家自然科学基金（31830057）、国家重点研发计划（2022YFF1001400）和湖北洪山实验室基金（2021hszd014）等经费的支持。