前人研究表明MdABI5是苹果花青素生物合成的关键正调节因子（图1b）。作者将MdABI5的启动子片段连接到葡萄糖醛酸酶（GUS）标记载体上，并将重组载体转化到苹果愈伤组织中，GUS活性测定表明MeJA处理可诱导MdABI5启动子驱动的GUS表达；qRT-PCR鉴定分析结果显示，MeJA处理诱导MdABI5表达，而GA处理抑制MdABI5的表达（图1c、d），表明MeJA和GA拮抗调节MdABI5表达。

接下来，作者发现MeJA处理明显增加了苹果果实中花青素的积累，但抑制MdABI5表达显著减弱了MeJA诱导的花青素生物合成的作用（图1e、f）。此外，MdABI5的过表达能够减弱GA对花青素生物合成的抑制作用（图1g，h）。这些结果表明MdABI5在MeJA和GA对花青素生物合成的调控中起着重要作用。

用MeJA处理过表达MdNAC72启动子的苹果愈伤组织，通过GUS活性检测表明MeJA处理能够诱导MdNAC72启动子驱动的GUS表达，而GA抑制MdNAC72启动子驱动的GUS表达（图3a）；qRT-PCR鉴定分析表明，表明MeJA处理能够诱导MdNAC72基因表达，而GA抑制MdNAC72基因表达（图3b）；此外在苹果愈伤组织中抑制MdNAC72的表达显著减弱了MeJA对花青素生物合成的促进作用（图3c、d），表明MdNAC72正向调节MeJA诱导的花青素生物合成。通过Y2H、pull-down和BiFC检测分析发现MdNAC72直接与MdJAZ2基因末端的ZIM结构域互作（图3e-h）。

接下来作者共表达MdNAC72和MdJAZ2的转基因苹果果实和愈伤组织发现，过表达MdJAZ2会降低MdNAC72促进的花青素生物合成，而抑制MdJAZ2表达会增加MdNAC72介导的花青素积累（图3i、j）；通过荧光素酶互补成像（LCI）和凝胶迁移实验（EMSA）鉴定分析发现MdJAZ2的增加降低了MdNAC72与MdABI5启动子片段的结合强度（图3k、l、m）；另外MdJAZ2表达对MdABI5的启动子表达没有显著影响，但MdJAZ2和MdNAC72的共表达降低了MdNAC72对MdABI5启动子的激活作用（图3n），这些结果表明，MdJAZ2通过干扰MdNAC72-MdABI5相互作用和抑制MdNAC72介导的MdABI5的转录激活，负向调节MdNAC72诱导的花青素生物合成。

用GA处理WT和MdNAC72转基因愈伤组织发现，过表达MdNAC72明显损害了GA对花青素生物合成的抑制作用（图4a、b），表明MdNAC72负向调节GA抑制的花青素生物合成；通过Y2H、pull-down和BiFC检测发现MdNAC72与MdRGL2a的C末端GRAS结构域相互作用（图4c-f）。

作者在过表达MdNAC72和抑制MdRGL2a表达的转基因苹果果实和愈伤组织中，发现抑制MdRGL2a表达可有效降低MdNAC72对花青素生物合成的促进作用（图4g，h）；另外通过竞争性结合试验检测和LCI测定分析发现，MdRGL2a抑制MdJAZ2和MdNAC72之间的相互作用（图4i）；但是GA可以部分阻止MdRGL2a对 MdJAZ2-MdNAC72相互作用的干扰（图4j）。

MeJA处理降低了MdNAC72的泛素化活性并增加了其蛋白水平，而GA诱导了MdNAC72的泛素化修饰并降低了MdNAC72蛋白的丰度（图5a、b）；Y2H测定、Pull-down和BiFC检测结果揭示了MdSINA2和MdNAC72之间的相互作用（图5c、d、e）。

另外，作者发现MeJA抑制MdSINA2表达，GA激活MdSINA2表达（图5f），分别在苹果果实和愈伤组织中转染过表达和抑制的MdSINA2质粒，经过测定分析发现过表达MdSINA2导致花青素生物合成相关基因的表达下调，减少花青素的积累；抑制MdSINA2表达显示出相反的表型（图5g、k）。这些结果表明，MdSINA2负向调节花青素的生物合成。

这篇文章探索了JA和GA拮抗调控花青素生物合成的机制。MdNAC72通过与MdABI5的相互作用增强其对靶基因的转录激活活性，协同调控花青素生物合成；MeJA信号抑制因子MdJAZ2破坏MdNAC72-MdABI5复合物的形成并抑制MdNAC72对MdABI5的转录激活，从而抑制MdNAC72介导的花青素生物合成；GA信号抑制因子MdRGL2a通过从MdJAZ2-MdNAC72复合体中分离MdJAZ2来激活MdNAC72对花青素生物合成的促进作用。E3泛素连接酶MdSINA2促进MdNAC72的泛素化降解，负向调节MdNAC72介导的花青素生物合成。

图6 | MdNAC72整合JA和GA信号调控苹果花青素生物合成的模型