2025年9月10日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心韩硕研究员团队联合复旦大学附属中山医院高强教授团队在Nature上发表了题为”Amplifying antigen-induced cellular responses with proximity labelling“的研究论文，提出了一种突破性的肿瘤免疫治疗新策略。该研究创新性地利用邻近标记技术（proximity labelling），开发出红光或超声波激活的工程化纳米酶（PCN），实现了在靶细胞表面原位、高密度构建人工抗原簇（PATCH技术），有效克服了传统免疫治疗中抗原密度不足和靶向特异性差的问题。并在小鼠肿瘤模型及病人来源组织中验证了该策略可显著增强T细胞活化和肿瘤杀伤效果，不仅拓展了邻近标记技术的应用边界，也为抗原依赖的免疫治疗提供了新思路。本项目由欧易生物提供单细胞转录组测序的服务内容。
发表期刊：Nature
影响因子：48.5
涉及的欧易生物服务产品：单细胞转录组测序
大多数天然存在的抗原，例如肿瘤相关抗原，由于密度不足，刺激的受体聚集有限，导致靶向反应不足。为解决这个问题，以往集中在设计优化嵌合抗原受体（CAR）或抗体，使其能够识别抗原水平低的细胞，但该策略需要针对单个构建体量身定制的复杂蛋白质工程，并可能加剧靶向非肿瘤毒性。其他的方法，如抑制内吞作用以增加表面抗原可用性或者通过溶瘤病毒转导诱导外来抗原表达，则存在抗原扩增效率低或缺乏细胞特异性等局限性。邻近标记技术作为一种化学工具，传统上用于空间邻近蛋白质的标记与鉴定，但其在抗原工程中的应用尚未探索。通过改造邻近标记技术，在体内高密度、特异性放大合成抗原簇，可克服天然抗原的局限性，为增强受体依赖的免疫应答提供新策略。
本研究开发了一种由红光或超声波调控的体内邻近标记技术，可在目标抗原周围实现高密度荧光素探针的共价标记。以T细胞受体为模型系统，证实经扩增的荧光素能有效聚集并结合荧光素特异性双功能T细胞衔接器（BiTE），显著增强T细胞活化与细胞毒性。在多种同源小鼠肿瘤模型中，这种非侵入性、组织选择性的标记技术可激发强效免疫应答，实现治疗肿瘤的快速清除。高效的靶细胞裂解进一步促进表位扩散效应，诱导机体产生针对远端未治疗病灶的系统性免疫应答，并形成抵抗肿瘤再攻击的免疫记忆。这些发现表明，邻近标记化学有望成为调控抗原依赖性受体功能及细胞状态的普适性策略。
Result 1 利用纳米酶实现混杂标记
基于当前邻近标记工具在体内应用的局限性，作者合成了一种平均直径为40 nm，以卟啉为催化活性中心的工程化纳米酶PCN（图1b,c），可通过红光（>650 nm）或超声波激活以实现深组织穿透的靶向标记。体外红光激活研究显示，PCN在红光（682 nm）照射下催化生物素-酚标记牛血清白蛋白（BSA），可能通过生成苯氧自由基中间体修饰酪氨酸残基。该过程可被氧化淬灭剂（如特丁基对苯二酚、叠氮化钠）抑制（图1d），且标记效率随光照时间增加。此外对标记的BSA进行了胰蛋白酶消化，并通过质谱分析所得的生物素化肽，观察到了修饰酪氨酸残基，进一步证实了苯氧自由基机制（图1e）。体外超声激活研究显示，在仅5分钟的超声波暴露后，PCN纳米酶使用亲核伯胺探针（生物素-胺）有效地生物素化了BSA，且此过程对单线态氧抑制剂敏感（图1f）。标记肽的质谱分析也证实了共价生物素化组氨酸残基的存在（图1g）。综上，利用PCN纳米酶在体外可通过红光或超声波作为触发条件，实现基于高活性中间体的混杂性蛋白标记。
图1 基于含卟啉纳米酶的混杂性蛋白质标记
Result 2 细胞表面邻近标记
作者进一步探索了利用PCN纳米酶实现细胞表面邻近标记的可行性（图2a）。通过靶向三种肿瘤相关抗原（HER2、FOLR和CD44v6），构建了工程化纳米酶PCN：FA-PCN、HA-PCN和HER2-PCN。作者在表达对应抗原的细胞系（4T1-CD44v6、M109-FOLR、CT26-HER2）中进行红光激活的邻近标记，共聚焦显微镜成像显示，使用膜不通透的生物素-酚底物时，各工程化PCN纳米酶能特异性诱导目标细胞的表面生物素化（图2b）。阴性对照（HEK293T和野生型CT26细胞）无标记信号。生化分析表明，红光标记的4T1细胞和超声标记的CT26-HER2细胞裂解液中存在大量生物素化蛋白（图2c），符合混杂标记特征。为验证邻近依赖性，作者通过链霉亲和素磁珠富集4T1细胞的生物素化蛋白，经胰蛋白酶消化后进行LC-MS/MS分析（图2d）。以无HA-PCN或未修饰PCN组为对照，筛选出217个蛋白进行GO富集分析，结果显示参与细胞粘附的细胞表面和质膜蛋白相关通路被显著富集（图2e）。值得注意的是，HA-PCN的直接结合靶标CD44v6是第七个富集最显著的蛋白质（log₂[FC]=6.8, P=0.0002），这一结果与在催化剂位点观察到的最高标记密度一致（图2f）。且蛋白质互作网络分析中CD44v6作为枢纽节点（图2g），证实标记具有空间定位特性。综上，工程化纳米酶PCN能够高效地催化空间受限的、邻近依赖的生物素探针在靶细胞表面的混杂标记。
图2 深红光或超声波调控的细胞表面邻近标记
Result 3 PATCH刺激TCR激活
为进一步评估局部抗原扩增技术（PATCH）在增强受体聚集中的作用。作者设计了低毒性的异硫氰酸荧光素（FITC）探针（FITC-酚/FITC-胺），当其共价连接蛋白质时会表现出高免疫原性（图3a）。荧光成像显示，在4T1、M109和CT26-HER2细胞上，光激活的FITC标记能有效地被相应的工程化PCN纳米酶催化，而未修饰的PCN纳米酶则不能（图3b）。与直接偶联FITC的配体或抗体相比，邻近标记的催化扩增效应使荧光强度提升10-30倍（图3c）。以T细胞受体（TCR）为模型，研究证实高密度FITC-PATCH可引导FITC结合的双特异性T细胞衔接器（BiTE）驱动TCR聚集（图3d）。作者构建了小鼠/人源FITC特异性BiTE，将小鼠FITC BiTE加入小鼠脾T细胞后，与未标记PATCH的对照组相比，诱导了对标记有PATCH的4T1细胞的显著杀伤（4.7倍，P=0.002）（图3e），并促进TNF（5.8倍，P=0.002）和IFNγ（4.7倍，P=0.001）分泌（图3f）。随后作者定量评估了PATCH的敏感性，针对NY-ESO-1(9V)肽的T1-PCN标记较传统抗体检测限降低>250倍（图3g），且较常规T1-BiTE显著提升T细胞的抗原敏感性和肿瘤杀伤效率（图3h）。为获得更多的机制见解，作者进一步对培养物中的T细胞裂解物进行蛋白质印迹分析，PATCH标记通过增强TCR下游信号分子磷酸化（如LCK(Tyr394)和LAT(Tyr191)）激活T细胞（图3i,j），证实高密度PATCH通过驱动TCR聚集有效激活下游信号通路，实现体外靶细胞清除。
图3 在靶细胞表面形成的PATCH触发T细胞受体（TCR）激活和T细胞毒性
Result 4 PATCH在体外触发T细胞激活
在复杂的组织微环境中，多种抑制机制共同拮抗受体聚集诱导的激活及下游信号传导。为验证PATCH技术能否克服这些抑制，作者采用患者来源的体外模型（重现天然组织结构）进行验证（图3k）。作者首先使用从乳腺癌、胃癌或结肠癌患者中获得的HER2⁺肿瘤细胞建立了三个肿瘤类器官。经PATCH标记并与PBMCs共培养后，BiTE治疗可有效清除50%的HER2⁺乳腺癌/胃癌细胞和90%的HER2⁺结肠癌细胞，证实PATCH在类器官模型中能诱导强效T细胞毒性（图3l）。随后作者进行了肿瘤片段分析，在8例HER2⁺患者肿瘤片段（含1例乳腺癌、1例胃癌、6例结肠癌）中，PATCH显著促进7例的T细胞活化（与未处理对照相比增加1.6-20倍），仅1例结肠癌无响应（图3m）。协同增效机制研究方面，PATCH与PD-1抗体联用时，CD69⁺T细胞比例和效应细胞因子分泌有小幅增加（图3n）。综上，表明PATCH在诱导肿瘤微环境（TME）中的T细胞活化方面非常有效且广泛适用。
Result 5 PATCH在体内根除实体瘤
作者进一步研究了PATCH技术在多种免疫活性小鼠肿瘤模型中的治疗效果。首先在患有皮下4T1乳腺肿瘤的小鼠中，通过静脉内（i.v.）或瘤内（i.t.）注射HA-PCN和FITC-酚并进行红光照射（682 nm, 30分钟），有效地实现肿瘤特异性PATCH标记（图4a）。仅经过两轮标记和BiTE给药后，就观察到小鼠的肿瘤完全缓解，对照组实验表明，等摩尔剂量的HA-FITC、省略FITC-酚均无法抑制肿瘤进展（图4b-c），证明肿瘤消退依赖于PATCH诱导的TCR集聚效应。为了进一步了解PATCH标记后T细胞的功能，作者对处理和未处理的肿瘤进行了单细胞转录组分析，结果显示在处理的样本中，终末耗竭T细胞特征（包括共抑制受体Pcddcl1、Lag3和Havcr2的表达）显著减少（图4d,e）。综上表明PATCH在体内驱动有效的T细胞活化并防止其耗竭，从而诱导强大的T细胞免疫力。该现象在两种激活方式（红光/超声波）及多种肿瘤模型（M109肺癌、CT26-HER2结肠癌、SK-OV-3人源化模型）中均获验证（图4f-m）。
图4 PATCH诱导T细胞活化并清除小鼠实体瘤
Result 6 PATCH驱动系统性抗肿瘤免疫
基于PATCH技术介导的高效T细胞激活和肿瘤细胞杀伤能力，作者推测通过细胞裂解释放的肿瘤抗原将被抗原呈递细胞摄取，以促进T细胞启动和系统性抗肿瘤反应。对此作者构建了双侧肿瘤小鼠模型（图5a），发现仅对原发瘤进行PATCH标记和BiTE治疗后，原发肿瘤显示出显著高比例的浸润性CD4⁺和CD8⁺T细胞，未照射的继发瘤也出现T细胞浸润显著增加（图5b-c）；PATCH标记的原发肿瘤完全消退，继发瘤的生长也受到了显著抑制（图5d）；生存分析也显示PATCH治疗小鼠的总生存期与未治疗小鼠相比显著改善（图5d）；此外原发和继发肿瘤均比未治疗肿瘤表现出更高水平的细胞死亡（图5e），表明成功诱导了远隔效应（abscopal effect）。为验证免疫反应的特异性，研究者将继发瘤替换为H2匹配但遗传学不同的H22肿瘤细胞（图5f）。结果显示H22肿瘤生长未受显著抑制（图5g），表明免疫应答具有肿瘤抗原特异性。过继转移实验证实CD8⁺T细胞是介导该效应的关键效应细胞（图5h-i）。更值得注意的是，经PATCH治愈的小鼠在肿瘤再攻击实验中（图5j）表现出完全的保护性免疫记忆——所有治愈小鼠（6/6）在无二次治疗的情况下完全排斥重新接种的同种肿瘤（图5k-l），而对照组小鼠肿瘤快速进展。这表明局部PATCH治疗不仅能重塑局部免疫微环境，还可诱导针对远端转移灶的系统性免疫清除和长效免疫记忆，为肿瘤免疫治疗提供了新策略。
图5 PATCH诱导系统性免疫及抵御肿瘤再攻击的免疫记忆
该研究开发了一种创新的邻近标记策略，通过在目标肿瘤细胞表面高密度地人工扩增与锚定合成抗原（FITC），有效克服了自然肿瘤抗原密度不足的瓶颈，显著增强了受体（如TCR）的集聚和免疫信号激活。在多种同基因小鼠肿瘤模型和人源化肿瘤模型中，该方法介导的局部抗原富集显著提升了T细胞的杀伤活性，快速彻底地清除了经处理的肿瘤病灶。更为重要的是，高效的靶细胞裂解进一步促进了"远端效应"，成功诱导机体对未治疗的远端肿瘤产生系统性免疫力以及对肿瘤再激发产生长期免疫记忆。这一突破不依赖于特定天然抗原的表达水平或肿瘤特异性，大幅拓宽了免疫激活疗法的适用范围，为提升对实体瘤及转移灶的免疫治疗效果提供了新的通用方案。
参考文献：
Li, S., Men, Y., Wang, Z. et al. Amplifying antigen-induced cellular responses with proximity labelling. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-09518-6