2025年8月，南京鼓楼医院胰腺与代谢外科仇毓东&程浩&闫超团队联合南京大学、江苏分子医学实验室，

在Advanced Science（IF=14.1）在线发表题为“SP1-Mediated Glycolytic Reprogramming Promotes Tumorigenesis and Progression in Pancreatic Cancer”的重磅研究。该研究通过空间蛋白质组学，首次在5例PanIN微病变中系统描绘代谢重编程图谱，锁定转录因子SP1在PanIN阶段即显著上调，并通过激活PFKFB4驱动糖酵解重编程，促进PDAC发生与进展；并通过转基因KPC小鼠、PDO/PDOX模型及同位素示踪完成机制与转化验证。

【欧易生物为本研究提供空间蛋白质组学技术服务】

1. 人源标本：5例PanIN + 配对正常胰腺FFPE

2. 验证队列：20例PanIN IHC、40例PDAC TMA

3. 动物模型：Kras^LSL-G12D/+；Trp53^LSL-R172H/+；Pdx1-Cre (KPC)与Sp1条件敲除（KPSC）小鼠  

4. 类器官/细胞系：13株PDAC细胞系、3例PDO、PDO-PDOX、CDX裸鼠模型

1. 激光捕获显微切割（LCM）：0.1 mm²级病灶精准取材

2. 4D-DIA蛋白质组：timsTOF Pro2，>2600差异蛋白，深度覆盖低丰度转录因子

3. ChIP-seq：SP1全基因组结合图谱  

4. Stable-isotope tracing：¹³C6-Glucose示踪糖酵解通量  

5. Seahorse XF：实时ECAR/OCR评估代谢表型  

6. 多重免疫荧光&IHC：空间验证关键蛋白表达

1. 基于空间蛋白质组学揭示了胰腺上皮内瘤变（PanIN）中的代谢重塑

在确认PanIN 阶段即出现“糖酵解爆发”的过程中，作者首先利用LCM从5名 PDAC 患者 FFPE 切片中精确切取PanIN及配对正常胰腺组织（图1A），随后进行timsTOF Pro2 4D-DIA蛋白组检测，共鉴定2600个差异蛋白，其中PanIN中2203个上调、397个下调；Reactome与KEGG富集一致显示糖酵解通路显著激活（图1B-C），热图进一步展示HK2、PFKL、LDHA等关键糖酵解酶显著升高（图1D）。为在更大样本中验证，研究者对20例PanIN与配对正常胰腺进行IHC，证实HK2、PFKL、LDHA蛋白表达显著增高，而脂质代谢酶 CD36、ACSL4 及氨基酸代谢酶 GLS、GLUD1/2 显著下降（图 1E-L）。

图1

2. PanINs和PDACs中SP1的上调与患者预后不良相关

为了挖掘驱动上述代谢重编程的上游转录因子，作者将差异蛋白中的转录因子与代谢酶进行Sankey网络分析，锁定 SP1、KLF4 等5个核心调控节点（图 2A）；其中SP1位列 PanIN 中8个最显著上调转录因子之一（图 2B）。TRRUST数据库显示SP1与PDAC三大驱动基因MYC、TP53、SMAD4共享大量靶基因（图2C）。公共数据库GEPIA进一步证实SP1在PDAC组织中高表达（图2D），且Kaplan-Meier曲线表明SP1高表达患者总生存期显著缩短（图2E）。IHC结果显示22例PanIN（图2F-G）及40例PDAC组织芯片（图2H-I）均呈现SP1核内高表达，且SP1与MYC表达呈正相关（图2J）。

图2 

3. SP1促进PDAC肿瘤生长

为功能验证SP1促瘤作用，作者首先在3DPDO模型中加入SP1抑制剂TA或MIT，可见类器官生长受抑（图3A）；WesternBlot证实SP1及其下游VEGFA蛋白随药物剂量依赖性下降（图3B-C）。将PDO进行NCG小鼠原位移植建立PDOX模型后，口服TA或腹腔注射MIT均显著抑制肿瘤体积与重量（图3D-E），IHC显示SP1、Ki67表达同步下降（图3F）。在13株PDAC细胞系中，FG与HPAF-II的SP1蛋白水平较高（图3G），shRNA敲低SP1后细胞增殖及克隆形成显著受抑（图3H-L），裸鼠原位移植同样证实SP1缺失明显减小肿瘤重量（图3M-P）。

图3

4. SP1基因敲除抑制Kras^LSL-G12D/+、Trp53^LSL-R172H/+和Pdx1-Cre（KPC）小鼠的PDAC肿瘤形成

为在体内遗传学水平验证SP1的作用，作者通过将Sp1^LoxP/LoxP小鼠与KPC小鼠杂交得到KPSC条件敲除模型（图4A）。多色免疫荧光显示KPSC胰腺中CK19阳性区域、α-SMA阳性CAF区域及Vimentin表达均随时间显著低于KPC对照（图4B-E）。AlcianBlue、Ki67、SiriusRed染色依次表明KPSC小鼠黏液分泌减少（图4F,J）、增殖指数降低（图4G,K）及纤维化减轻（图4H,L）。代谢酶IHC显示KPSC胰腺中HK2、PFKL、LDHA表达下调（图4I）。生存曲线显示SP1缺失显著延长KPC小鼠总生存期（图4M）。

图4

5. SP1调节PDAC细胞有氧糖酵解

为解析SP1如何调控糖酵解，作者在FG细胞中进行ChIP-seq鉴定SP1全基因组结合位点（图5A），并与SP1敲低后的RNA-seq差异基因取交集，获得677个潜在靶基因（图5C）；Wikipathways与KEGG分析均显著富集糖酵解通路（图5D），热图显示关键糖酵解酶表达受SP1正调控（图5E）。Seahorse实验表明SP1敲低显著降低ECAR与ATP生成率，而OCR无明显变化（图5F-H）。13C6-葡萄糖同位素示踪进一步证实SP1缺失导致糖酵解中间产物F-1,6-BP等下降，而TCA循环中间产物代偿性升高（图5I）。

图5

6. SP1转录激活PDAC细胞中的PFKFB4

在明确SP1通过转录激活PFKFB4的机制研究中，RT-qPCR显示SP1敲低后PFKFB4 mRNA下降最显著（图6A），且F-1,6-BP含量同步减少（图6B）。Western Blot证实SP1缺失降低PFKFB4蛋白水平（图6D）。双荧光素酶报告基因实验表明SP1可增强PFKFB4启动子活性，且活性区定位于−1300~−1000nt（图6E-H）；突变分析进一步将关键结合位点锁定在−1230~−1221nt与−1203~−1193nt（图6I-J）。ChIP-qPCR最终验证SP1直接结合PFKFB4启动子（图6K）。

图6

7. SP1通过激活PFKFB4调节PDAC细胞的有氧糖酵解

为证明PFKFB4是SP1介导糖酵解及增殖的关键下游，作者在FG细胞中分别敲低/过表达PFKFB4（图7A-C）。代谢检测显示PFKFB4缺失同样降低F-1,6-BP与F-2,6-BP水平，而过表达PFKFB4可挽救SP1敲低导致的代谢抑制（图7D-E）。Seahorse结果一致表明PFKFB4过表达恢复SP1缺失细胞的ECAR（图7F-H）。体外增殖与克隆形成实验进一步证实PFKFB4过表达可逆转SP1敲低造成的生长抑制（图7I-J）。在FG-luc原位移植模型中，PFKFB4过表达同样逆转SP1缺失导致的肿瘤生长受阻（图7K-N）。临床样本IHC显示75例PanIN中SP1与PFKFB4同步高表达（图7O-R）。

图7

8. SP1抑制剂TA与PFKFB4抑制剂5MPN单药及联合疗效

最后，作者在FG原位移植模型中评估SP1抑制剂TA与PFKFB4抑制剂5MPN的单药及联合疗效。结果显示单药即可显著抑制肿瘤重量，半剂量联用效果最佳且对小鼠体重无明显影响（图8A-D）。机制示意图总结SP1通过直接激活PFKFB4转录，增强PFK-1活性，加速糖酵解通量，从而推动胰腺癌发生与进展（图8E）。

图8

本研究以空间蛋白质组学为核心，首次在人源PanIN水平证实：SP1-PFKFB4轴介导的糖酵解重编程是胰腺癌“极早期”驱动事件。靶向该轴不仅能延缓甚至阻断PanIN向PDAC演进，还为临床提供了可转化的早诊标志物（SP1/PFKFB4）及联合干预策略。

1. 技术创新：首次实现PanIN微病变空间蛋白质组学研究，突破FFPE样本低丰度限制。

2. 临床价值：SP1/PFKFB4双重抑制剂已进入动物验证阶段，为胰腺癌“早筛+早治”提供候选方案。

3. 组学应用：多组学研究交叉验证，确保机制链完整闭环。

4. 适用研究：若正在开展肿瘤早筛标志物、代谢重编程或转录调控研究，可参考本研究的“空间蛋白质组学”策略，以微量临床样本撬动大发现！

【参考文献】

Hang, H., Yu, M., Zhu, L., Tang, N., Fu, X., Cai, Z., Yan, M., Chen, Y., Yang, L., Wu, J., Tang, J., Xie, Y., Li, Q., Fu, X., Mao, L., Chen, J., Meng, F., Kong, B., Han, X., Yan, C., Cheng, H. (2025). SP1-Mediated Glycolytic Reprogramming Promotes Tumorigenesis and Progression in Pancreatic Cancer. Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany), e10071. Advance online publication. https://doi.org/10.1002/advs.202510071