作者针对肿瘤细胞进行组间差异分析，结果显示PT上调基因富集于细胞周期通路，而RT上调基因富集于免疫应答通路，且RT样本展现出更高的免疫炎症和癌症信号，如NF-κB、PI3K-AKT、MAPK和P53通路（图2a-2b）。放疗抗性细胞系的bulk-RNA测序结果也证明RT的放疗抗性与NF-κB、MAPK和PI3K-AKT通路的上调相关（图2c）。此外，RT还体现出更强的免疫逃逸特征，在与免疫逃逸相关的基因中，RT样本的恶性细胞中 CD47 和 HLA-A/HLA-B/HLA-C 表达增加（图2e）。关于肿瘤的抗原性，PT和RT样本之间肿瘤抗原性（包括TMB、TNB和CNV）无显著变化,RT的肿瘤异质性显著低于PT样本(图2f)。关于免疫原性，RT样本中VCAM1的表达更高，而TNFRSF14、CD276、LGALS9和CD274在PT样本中的表达显著增加(图2g)。综上，RT具有高放疗抗性和免疫逃逸的能力，这些能力不依赖于免疫原性和抗原性降低的特定方式存在。

除了癌症相关通路的自我激活外，TME也可能促进rNPC恶性细胞放疗抗性的发展，细胞通讯分析结果显示，成纤维细胞与恶性细胞的相互作用数量最多（图2h-2j ）。通过对成纤维细胞（CAF）进行单细胞聚类分析，识别出四个亚群（图3a-3c），其中MCAM⁺mCAFs在复发性肿瘤（RT）中的比例显著高于原发性肿瘤（PT）（图3d）。该结果经多色免疫荧光技术证实，RT样本中可检测到大量ACTA2和MCAM双阳性成纤维细胞（图3e-f）。流式细胞分析进一步量化显示，RT样本MCAM⁺mCAFs占比中位数高达58.4%，约为PT样本（6.275%）的9倍（图3g）。临床预后分析表明，MCAM⁺mCAFs比例升高与更差的局部区域无复发生存率（LRRFS）和总体生存率显著相关（图3h-i）。

空间转录组分析揭示CAF MCAM亚群较其他CAF亚型显著贴近恶性细胞（P=0.0015），且毗邻CAF MCAM的恶性细胞表现出更强的肿瘤干性特征。从批量CAFs中分离的MCAM⁺mCAFs，并经Western blot验证其纯度（图3j）。当与 MCAM⁺mCAFs共培养时，C666和TWO3鼻咽癌细胞系减弱了γH2AX焦点吸收（图3k），且克隆数量增加，细胞凋亡减弱（图3m）。NCG小鼠皮下共注射模型进一步证实：与MCAM⁺mCAFs共注射的肿瘤在放疗后表现出更强的生长持续性（图3n-p）和凋亡抗性（图3q）。

作者通过对在MCAM⁺mCAFs中差异显著的基因进行网络分析，确定ACTA2、COL4A2、ITGA1及COL4A1为潜在的关键枢纽基因，其中分泌蛋白编码基因COL4A1、COL4A2、PDGFA与IGFBP7在单细胞与Bulk-RNA测序数据集均显著富集（图4a-b）。COL4A1和COL4A2编码IV型胶原的α1和α2链，作者发现IV型胶原蛋白在蛋白水平上在MCAM⁺mCAFs中表达上调（图4c,d）。体外实验表明，IV型胶原处理鼻咽癌细胞后，鼻咽癌细胞的放疗抗性显著提高（图4e-h ）。整合素是常见的胶原受体，细胞通讯分析表明，恶性细胞与MCAM⁺mCAFs通过COL4A1/2-ITGA2、ITGB1 和 COL4A1/2-ITGA3_ITGB1轴的串扰增强（图4i）。体外实验验证表明，当在C666和TWO3细胞中敲低ITGA2时，显著降低了外源处理IV型胶原诱导的放疗抗性（图4j-4k ）。体内实验也表明，ITGA2 KD的肿瘤细胞即使在与MCAM⁺mCAFs共注射并在晚期接受辐照时，其成瘤能力也较弱，且肿瘤细胞凋亡显著增加（图4l-o）。先前的研究表明，胶原主要通过结合整合素激活下游的PI3K-AKT信号通路并发挥其生物学效应，经体内实验验证，当PI3K-AKT通路被抑制时，MCAM⁺mCAFs的促瘤作用显著减弱（图4p-4s）。综上，MCAM⁺mCAFs通过分泌IV型胶原激活肿瘤细胞表面受体ITGA2介导放疗抗性。

先前研究表明，胶原可以调节白细胞向肿瘤的浸润，作者研究发现高表达的IV型胶原确实与更少的T细胞浸润相关（图5a），高水平的IV型胶原表达与T细胞浸润呈负相关（图5c），且与较差的总生存期（P=0.031）和更差的局部无复发生存率（LRRFS）（P=0.036）相关（图5d-5e）。一致地，更高的COL4A1转录水平与T细胞相关基因的较低表达显著相关（图5g），且与显著更差的的无进展生存期相关（图5f）。人源化小鼠模型中，与共注射MCAM⁺mCAFs或PBS对照相比，当共注射COL4A1敲除（KO）的MCAM⁺mCAFs时，肿瘤细胞成瘤能力较弱（图5h-5j ）。此外，在COL4A1 KO组和载体（vector）组中，MCAM和α-SMA的表达均高于PBS组，而载体组中的IV型胶原表达高于COL4A1 KO组和PBS组（图5k-5l）。在免疫荧光染色和流式细胞术分析中，载体组中CD4⁺和CD8⁺T细胞的比例显著低于COL4A1 KO组和PBS组（图5m,）。此外更高的IV型胶原评分与CD4⁺ T细胞（r=-0.523, P=0.026）和CD8+T细胞（r= -0.752, P=0.0003）的浸润降低显著相关（图5n）。综上所述，IV型胶原通过显著抑制T细胞浸润，介导鼻咽癌免疫逃逸，导致患者生存预后恶化。

在比较原发（PT）和复发（RT）鼻咽癌样本的TME差异时，作者发现rNPC中CD8⁺ZNF683⁺T细胞和CD8⁺PNRSR⁺T细胞的丰度显著高于pNPC（图6b）。通过Monocle 3的拟时序分析揭示了CD8⁺T细胞的分化轨迹：该过程起始于CD8⁺TCF7⁺T细胞，经历以CD8⁺FOSB⁺和CD8⁺ITM2C⁺为特征的中间细胞毒性状态，最终分化为两个终末亚群——CD8⁺TIGIT⁺的耗竭性T细胞与CD8⁺ZNF683⁺的记忆性T细胞（图6c）。在此分化过程中，细胞毒性和耗竭特征评分同步升高（图6d）。值得注意的是，初始CD8⁺TCF7⁺细胞主要分布于CD8⁺ ZNF683⁺细胞比例较低的原发肿瘤中，而CD8⁺ZNF683⁺细胞则在复发肿瘤中富集并呈现组织驻留特征（图6c-6e）。进一步分析表明，PT和RT样本间T细胞耗竭评分无统计学差异，但复发肿瘤中T细胞的共刺激功能显著减弱（图6f-6g）。在临床验证队列1中，RT样本的CD8⁺ZNF683⁺细胞比例显著升高（图6h-6i）。队列2的生存分析显示，该细胞高比例患者的总生存期（OS）和局部无复发生存期（LRRFS）显著缩短（图6j）。为解析其功能特性，研究者分离肿瘤浸润的CD8⁺ZNF683⁺和CD8⁺ZNF683⁻细胞群，通过流式细胞术检测细胞毒性标志物颗粒酶B（GZMB）的表达。结果显示CD8⁺ZNF683⁺细胞的GZMB表达显著降低，证实其细胞毒性功能减弱（图6k）。

作者先前观察到B细胞在复发性鼻咽癌中的比例显著减少，通过降维聚类分析，将B细胞分为五个亚群，其中，记忆B细胞在复发性鼻咽癌中的比例显著减少，而 B IGHM细胞的比例增加（图7a- 7e）。空间转录组学进一步揭示，pNPC中的CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、调节性T细胞和循环T细胞普遍更靠近B细胞（图7f）。组织学检测显，pNPC样本中肿瘤相关淋巴结构（TLS）阳性率达62.5%（5/8），而rNPC样本未见TLS阳性（0/7）（图7g），且TLS内观察到CD20+B细胞与T细胞亚群及滤泡树突状细胞共定位（图7h）。在验证队列中进一步证实，PT样本中的TLS密度高于RT样本（图7i），较高的TLS密度与显著更好的生存结局相关（图7j-7k），TLS状态为阴性的患者在接受抗 VEGFR 和PD-1抑制剂治疗后，无进展生存期结果更差（图7l）。

作者进一步在髓系谱系中鉴定出11个亚群，包括5个巨噬细胞亚群，1个单核细胞亚群，4个树突状细胞亚群和一个活跃增殖细胞亚群（图8a-8b）。单核细胞 FCN1表现出FCN1、VCAN、S100A8和S100A9的高表达，且在复发性鼻咽癌中的比例高于原发性鼻咽癌（图8c-8d）。多色免疫荧光染色验证了RT样本与PT样本相比，单核细胞 FCN1的丰度增加（图8e-8f）。 基于空间转录组学分析显示，与原发性鼻咽癌相比，髓系细胞在复发性鼻咽癌中明显更靠近肿瘤细胞，并表现出更显著的相互作用对（图8g）。细胞通讯表明，rNPC中恶性细胞与髓系细胞通过CD47^- SIRPα 存在更密切的相互作用（图8h）。此外，在RT样本中，靠近CD47阳性恶性细胞的髓系spots显示出显著更高的 SIRPα 表达水平（图8i)。多色IHC同时证实SIRPα⁺CD1C⁺树突细胞定位于CD47⁺复发恶性细胞周边（图8j）。