2024年2月15日，华中科技大学附属同济医院谌科教授，陶振教授，管维教授和海军军医大学附属长征医院任善成教授合作在Nature Genetics（IF：30.8）在线发表题为“Multi-omic profiling of clear cell renal cell carcinoma identifies metabolic reprogramming associated with disease progression”的研究论文。该研究基于ccRCC肾癌大队列转录组、蛋白组、代谢组、空间转录组、空间代谢组等多组学数据以及公共数据，揭示了ccRCC的进展机制，并提出一种新型分子分型诊疗策略，可以用来指导ccRCC的临床治疗。欧易生物有幸提供了空间代谢组、单细胞转录组测序以及空间转录组测序等服务。

发表期刊：Nature Genetics

影响因子：30.8

材料：100份未经治疗的ccRCC样本、50份配对的正常邻近组织（normal adjacent tissues，NATs）；

方法：全外显子测序（whole-exon sequencing，WES）、全转录组测序（whole-transcriptome sequencing，WTS）、蛋白质组、非靶向代谢组学、空间代谢组、空间转录组；（其中空间代谢组、空间转录组、单细胞转录组测序由欧易生物提供技术支持）

肾细胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是全球十大常见恶性肿瘤之一，主要表现为透明细胞肾细胞癌（clear cell RCC，ccRCC）。尽管代谢紊乱是ccRCC的关键特征，但目前研究集中于代谢组分析，并未充分探讨基因组等变化与代谢紊乱之间的关联。因此本研究使用包括空间代谢组、空间转录组等技术深入探讨了ccRCC中肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）变化，揭示了ccRCC去脂质透明细胞分化的广泛恶性进展模式。

1. 同济医院RCC（Tongji Hospital RCC，TJ-RCC）队列的多组学特征描述

作者首先利用全外显子测序（whole-exon sequencing，WES）、全转录组测序（whole-transcriptome sequencing，WTS）、蛋白质组学和非靶向代谢组学对总共100份未经治疗的ccRCC样本和50份配对的正常邻近组织（normal adjacent tissues，NATs）进行了分析（样本策略），以确定TJ-RCC队列的一般分子特征。

基因组结果发现，本研究中最常发生突变的基因与之前的研究一致（图 1b），例如VHL、PBRM1、BAP1、SETD2和KDM5C是ccRCC中最常见的突变基因。49个肿瘤被证实具有马兜铃酸（aristolochic acid，AA）相关突变特征，但这些肿瘤中，频繁突变的基因突变率并没有明显升高（图1c）。由于主要的ccRCC驱动突变显然与AA依赖性诱变无关，这些数据表明AA在ccRCC中的作用值得重新评估。

通过分析转录组、蛋白组数据，作者发现肿瘤和NATs之间存在显著差异（图 1d）。在ccRCC组织中，血管生成、糖酵解和免疫相关通路被激活，同时一些代谢通路被抑制（图1e，f）。代谢组分析结果与转录组和蛋白质组分析结果一致（图 1g），但甘油脂代谢和谷胱甘肽（glutathione，GSH）代谢途径除外。并发现脂滴（lipid droplets，LDs）的积累是ccRCC的一个特征，可能是由β氧化活性降低引起的。

图1 TJ-RCC队列的多组学特征

2. ccRCC可分为四种免疫亚型

本研究中，作者从一个公开的scRNA-seq数据集中生成了一个ccRCC特异性特征矩阵，并确定了25种不同的细胞类型。该矩阵用于将肿瘤样本分为四种免疫亚型（IM1-IM4）。这四种免疫亚型中，IM1肿瘤的特征是内皮细胞（图 2a）和基质细胞特征丰富，而免疫细胞特征缺乏，表明存在免疫排斥。IM2肿瘤也具有丰富的内皮细胞特征，而免疫细胞和基质细胞特征缺失。

在这四个亚组中，IM3肿瘤的内皮细胞和基质细胞特征水平最低，但T细胞和肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）得分增加。IM4肿瘤的基质和TAM评分最高，T细胞评分居中。接下来，作者研究了基因组和临床特征是否与免疫亚型相关。IM4中染色体臂级体细胞拷贝数改变（somatic copy number alteration，SCNA）最多，其次是IM3，而体细胞突变负荷（即单核苷酸变异）在四个组中没有差异（图 2b，c）。SCNAs较多的亚组与较高的肿瘤分级和较晚期的疾病有关（图 2d）。这些结果使用了免疫组化等方法进行了验证。

图2 ccRCC肿瘤微环境的分子分型

3. 支撑IM1-IM4的免疫细胞群体

为了进一步探究IM亚型下免疫细胞组成的异质性，作者对10个样本（4个IM1、2个IM2、2个IM3和2个IM4）进行了单细胞转录组测序（single-nucleic RNA-seq，snRNA-seq），另外对另外10个样本（1个IM1，3个IM2，4个IM3和2个IM4）进行了单细胞ATAC 测序 （包括snRNA-seq和单核ATAC测序（snATAC-seq））。

本文将97978个单核分为5种主要细胞类型和41个亚类群（图2e，f）。并发现，在IM1和IM2中单核细胞、LILRB5+巨噬细胞、终末分化效应记忆或效应细胞（terminally differentiated effector memory or effector cells，TEMRA）和激活NK（activated NK，aNK）细胞占主导地位。IM3肿瘤中CD8+T细胞浸润增加。末期耗竭T细胞的比例在IM3肿瘤中也较高。IM3和IM4肿瘤的TAMs存在显著差异。在IM3肿瘤中也富集了增殖性巨噬细胞、GPNMB+巨噬细胞、C3+巨噬细胞和GBP1+巨噬细胞（图2g）。而IGF1+巨噬细胞在IM4肿瘤中更为丰富。

通路富集分析表明，这个亚型中生长因子复合物通路得到了富集（图2g）。IGF1+巨噬细胞的丰度与成纤维细胞评分呈正相关，但与其他基质细胞如外周细胞无关。免疫荧光染色揭示，IGF1+巨噬细胞（F13A1+）主要定位在富含成纤维细胞（PDGFRA+）的区域，这说明IGF1+巨噬细胞促进了IM4肿瘤中成纤维细胞的积累（图2h）。

4. 相关免疫和代谢异质性在肿瘤微环境中的情况

为研究肿瘤代谢在免疫亚型分层中的作用，作者评估了每个样本的代谢组学相关基因本体（Gene Ontology，GO）术语。聚类分析发现了四个不同的代谢基因表达簇，簇1涉及胶原蛋白和蛋白多糖代谢，可能与细胞外基质重塑有关。簇2与类固醇激素代谢有关。簇1和簇2的活性主要来自间质细胞和内皮细胞。簇1和簇2均富集于IM1和IM4肿瘤中。簇3与脂肪酸和氨基酸代谢有关，并在IM2和IM3中富集。而簇4主要与核苷代谢有关，而且核苷代谢单独能够区分IM3样本与其他亚型。

联合分析发现，IM3样本在转录组和蛋白质组水平上的胞嘧啶、嘧啶和其他核苷代谢通路得到了增强（图3b）。通过对公开数据的分析，作者基于Teff细胞的单个样本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）得分和嘧啶代谢之间的相关性分析表明，增加的嘧啶/胞嘧啶代谢活性与增加的CD8+T细胞浸润和不良预后相关，符合作者在TJ-RCC队列中发现的结果（图3c，d）。

此外，在代谢组数据中观察到IM3样本中嘧啶衍生物的增加（图3e）。但尽管IM3是一个CD8+T细胞浸润的亚组，IM3肿瘤仍然比IM4肿瘤有更好的预后。这些结果表明，在ccRCC中，CD8+T细胞浸润可能限制肿瘤的进展。

为验证这一发现，作者对12个肿瘤切片和2个NAT切片进行了空间转录组和空间代谢组分析。空间代谢组结果发现，在属于IM3组的CD8+T细胞浸润样本中检测到了高水平的鸟嘌呤和次黄嘌呤信号（图3f、g）。相反，在另一个具有局部淋巴细胞浸润的IM3样本中，仅在非TIL浸润区域检测到微弱的鸟嘌呤和次黄嘌呤信号（图3f、g）。这些发现表明ccRCC的肿瘤内异质性以及嘧啶衍生物和TILs之间的潜在相关性。这一假设在另一个局部CD8+T细胞浸润的样本中得到了进一步确认（图3h-l）。

图3 TME中免疫和代谢异质性的关系

5. IM4肿瘤显示出独特的代谢特征，并具有较差的预后

由于包括脂肪酸和氨基酸代谢在内的簇3在IM4亚型中下调，同时这些通路在ccRCC肿瘤中也是下调的。这说明IM4样本中代谢失调得到了增强。为了系统地研究这些差异，作者确定了IM4和其他肿瘤亚组之间的DEGs，并通过聚类分析，853个DEG被聚类成四个基因模块（图4a）。其中，IM4肿瘤中的模块1和2中的基因表达水平高于其他IM。但模块1的基因在NAT中的表达水平最高，主要在肾小管细胞中。而模块2的基因主要在集合管中。模块3基因在正常近端肾小管中表达较多，且在非IM4肿瘤中下调，在IM4肿瘤中进一步降低（图4a）。

这些基因富集于脂肪酸、氨基酸和碳水化合物的代谢途径（图4b）。这些途径的活性降低被描述为ccRCC的一个特征。与模块3中的基因相反，模块4中的基因在非IM4肿瘤中上调，在IM4肿瘤中下调至NAT水平以下（图4a）。ccRCC致癌基因HIF2A也包含在这个模块中。这些基因富集于多种生物合成途径，包括脂肪酸生物合成途径（图4b），导致肿瘤细胞中LD的积累。由于这些特征在IM4肿瘤中大体上被抑制，模块4相关的特征可能对ccRCC具有双重作用。

通过选择20个随机选取的TJ-RCC队列样本进行油红染色的验证显示，在表现出“透明细胞”表型的非IM4样本中出现了LD的积累，但在IM4样本中几乎没有观察到LD，符合转录组特征（图4c）。同时，与丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酸代谢以及精氨酸生物合成有关的代谢产物水平在IM1-IM3肿瘤中低于NATs。这些生物合成途径在IM4组中也被下调，与转录组发现相对应（图4d、e）。有限的精氨酸生物合成表明IM4肿瘤中的尿素循环受限（图4f、g）。值得注意的是，IM4肿瘤中的尿素循环功能障碍似乎并不依赖于酶失调，这暗示存在未知的机制（图4g）。相反，在IM4中GSH代谢被激活。这些分子可以消耗肿瘤细胞中的反应性氧化物（ROS），导致更高的增殖率和药物抗性。与GSH高三阴性乳腺癌不同，IM4肿瘤并不显示出GSH生物合成底物水平的升高（图4f，g）。

此外，参与GSH生物合成的大多数酶在IM4肿瘤中没有失调。只有GGT1被下调，这是一种催化GSH的谷氨酰基转移的酶（图4g）。虽然构成尿素循环的鸟氨酸水平在IM4肿瘤中降低，但两个与癌细胞增殖有关的鸟氨酸衍生物，精胺和亚精胺的水平仍然大幅增加（图4f，g）。考虑到代谢能量生成途径的下调和增殖速率的增加，IM4肿瘤可能具有替代性能源。

作者发现，编码葡萄糖转运蛋白（SLC2A1和SLC2A3）、谷氨酰胺转运蛋白（SLC1A5和SLC38A5）、支链氨基酸转运蛋白（SLC7A5）和硫胺素转运蛋白（SLC35F3）的基因表达被上调（图4h），可能导致IM4肿瘤中营养物质的摄取增加。一种新的烟酰胺单核苷酸转运蛋白SLC12A8的水平在IM4肿瘤中也增加了（图4h）。尽管IM4肿瘤可能会摄取额外的葡萄糖，但只有糖酵解发酵过程被增强，而葡萄糖异生在这个组中被抑制（图4i）。这些结果说明，IM4肿瘤的特征包括营养物质的摄取增加、ROS和LD水平降低、代谢活性较低以及更高的增殖率（图4j）。

由于ccRCC的特征是癌细胞内LD的积累，因此作者将这个过程命名为ccRCC的去透明细胞分化（de-clear cell differentiation，DCCD）。此外，由于IM4肿瘤已经完成了这个转化过程，因此被称为DCCD-ccRCC。由于早期（I、II期）诊断的原发肿瘤患者不接受术后药物治疗，作者想知道早期DCCD肿瘤患者是否有更差的预后。结果发现，在I和II期ccRCC患者中，原发肿瘤被分层为DCCD肿瘤的患者总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期（progression-free survival，PFS）明显较差（图4k）。这表明单纯的手术治疗不太可能治愈这些患者。这些数据表明，应该鉴定出具有局限性DCCD-ccRCC的患者，并在手术后提供进一步的治疗。

图4 ccRCC中的DCCD亚型显示出动态代谢失调

6. IM亚型与治疗反应有关

为了确定针对DCCD（IM4）和非DCCD（IM1-IM3）ccRCC患者的潜在治疗方案，作者分析了来自三项临床试验的RNA-seq数据。atezolizumab（PD-L1抑制剂）和bevacizumab（血管内皮生长因子抑制剂）联合使用sunitinib（受体酪氨酸激酶抑制剂）能够改善IM3和DCCD（IM4）组的预后（图5a-c）。与单独使用sunitinib相比，avelumab（PD-L1抑制剂）和axitinib（VEGFR抑制剂）联合治疗改善了IM1、IM3和IM4组的无进展生存期（图5f）。

因此，以高度表达血管生成相关基因为特征的IM1组可能会从avelumab+axitinib治疗中获益（图5c、f）。值得注意的是，抗血管生成治疗与免疫检查点阻断联合使用对IM2患者无益。在everolimus（mTOR抑制剂）治疗组中，IM3肿瘤的患者具有最短的OS和PFS。相比之下，与everolimus（mTOR抑制剂）相比，nivolumab（PD-1抑制剂）治疗延长了IM2和IM3患者的OS时间（图5i）。与everolimus相比，nivolumab可能是更适合IM2和IM3患者的二线治疗选择。

图5 IM亚型与治疗反应有关

7. ccRCC中从非DCCD到DCCD的亚群水平转变

本文前部分的研究表明，在IM1-4样本中，IM2和IM4得分居中，这在公共数据中也得到了验证（图6a），支持了ccRCC中存在DCCD发展的假设。因此，作者根据显性基因特征将这些样本命名为IM2-like或IM4-like，并将DCCD评分定义为IM4和IM2评分的D值（图 6a，b）。

鉴于IM2和IM2-like组主要包含低分化的早期肿瘤，作者分析了公共数据中的I期病例。发现在这些早期病例中，IM4评分越高，预后越差，这表明DCCD的进展程度可能会决定ccRCC患者的预后。接下来，作者对snRNA-seq数据进行分析。结果发现，IM2和IM4分数之间存在相同的反相关性（图 6d、e）。

因此，作者根据DCCD评分将单个癌细胞分为IM2样或IM4样表型。有趣的是，IM2-like或IM4-like细胞的比例与转录水平上的DCCD得分相关（图6f），这表明DCCD过程反映了肿瘤内IM4-like癌细胞的积累。由于DCCD-ccRCC通常比IM1-IM3肿瘤含有更多的染色体臂级SCNA（图4a），作者接下来想探究SCNA是否驱动了DCCD过程。

在TJ-RCC和TCGA KIRC队列中，SCNA事件的数量呈现出相同的趋势：IM4>IM4-like>IM2-like≈IM2。在snRNA-seq数据中，只有两个肿瘤的部分恶性细胞表现出DCCD特征（部分DCCD；图6g），可以发现亚克隆SCNA。在12个具有空间轮廓的ccRCC样本中，有两个样本发现了部分DCCD（图 6h，i）。值得注意的是，Y7_T在bulk-seq和snRNA-seq数据中都显示出IM2特征（图6f），在visium切片中显示出亚克隆DCCD转移，反映了DCCD诱导的ITH。非DCCD区域表现出经典的“透明细胞”表型（图 6h），与油红染色观察到的表型一致（图 4c）。在X98_T的DCCD区域可以发现9号染色体缺失，这与snRNA-seq数据一致（图 6g，j）。综上所述，这些结果表明SCNA事件与DCCD之间没有绝对的相关性。空间代谢组分析表明，无论是否存在亚克隆SCNA，DCCD区域的脂肪酸（尤其是长链脂肪酸）都较少（图 6k，l），从而导致这些区域的LD积累减少。

图6 在ccRCC中可以观察到从非DCCD到DCCD的偏移

8. 确定通向DCCD的轨迹

为深入了解向DCCD转化的过程，作者运用snRNA-seq数据构建了一个轨迹。IM4样单细胞位于轨迹末端的中心。在整个拟时序内，IM4分数增加，IM2分数减少（图 7a，b）。

随后，通过差异分析，发现83个差异表达转录因子被分为两个群组（图 7c）。HNF1A、HNF1B（肾小管发育所必需的转录因子，并与ccRCC肿瘤发生有关）、HNF4A（HNF1A的调节因子）以及PPARA（维持正常肾近端小管代谢特征的主要转录因子）均参与其中。它们的下调可能与DCCD肿瘤抑制近端肾小管特异性代谢特征有关（图 4a）。雄激素受体也在IM4样单细胞中下调。ccRCC中雄激素受体的缺失与较高的淋巴结转移率有关。HIF1A是RCC的传统肿瘤抑制因子，在向DCCD分化的后期阶段显著升高。HIF1A的上调与mRCC中较低的药物反应率有关。两个样本的空间轨迹与snRNA-seq数据的结果一致（图 7d-g）。由于部分DCCD样本是IM2样细胞和IM4样细胞的混合物，因此可以根据DCCD特征得分利用测序数据建立轨迹。